[发明专利]聚合酶链反应与短片段DNA测序相结合的诊断方法

说明书

技术领域

本发明聚合酶链反应与短片段DNA测序相结合的诊断方法涉及一种生物检测方法，尤其适用于进行遗传病的产前诊断、致病病原体的检测、癌基因的检测和诊断、DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴以及法医物证、动、植物检疫、高科技生物医学等领域研究。

技术背景

近年来，基因分析和基因工程技术有了革命性的突破，这主要归功于聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)的发展和应用。应用PCR技术可以使特定的基因或DNA片段在短短的2-3小时内体外扩增数十万至百万倍。扩增的片段可以直接通过电泳观察，也可用于进一步的分析。这样，少量的单拷贝基因不需通过同位素提高其敏感性来观察，而通过扩增至百万倍后直接观察到，而且原先需要一、二周才能作出的诊断可以缩短至数小时。PCR反应特异性强，灵敏度高，极微量的DNA即可作为扩增的模板得到大量的扩增片段。毛发、血痕，甚至单个细胞的DNA即可供PCR扩增之用。因此在不到10年的时间内，在遗传病的产前诊断、致病病原体的检测、癌基因的检测和诊断、DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证、动、植物检疫、高科技生物医学等领域中PCR技术已具有实用价值，且其应用范围正在不断扩大中。然而，正是由于PCR反应有赖于高度的特异性和灵敏度，在临床医学诊断中则常常出现意想不到的失误，导致不可信的诊断结果。最常出现的问题主要表现在以下两个方面。第一，假阴性：出现假阴性结果最常见的原因是：Taq DNA聚合酶活力不够，或活性受到抑制；引物设计不合理；提取的模板质量或数量不过关以及PCR系统欠妥当；循环次数不够。第二，假阳性：PCR结果的假阳性是对被检测标本而言，而反应系统中所扩增的产物是真实的。因为PCR技术高度灵敏，极其微量的靶基因污染都会造成大量扩增，而造成结果判断上的失误，所以污染是PCR假阳性的主要根源。PCR的污染主要是标本间的交叉污染和扩增子的污染。出现假阳性结果的另一种可能是样品中存在有靶基因的同源序列。为了避免因污染而造成的假阳性，PCR操作时要隔离不同操作区、分装试剂、简化操作程序，使用一次性吸头。

上述两个问题中，假阴性问题在长期的试验中已经有了比较多的经验和解决方法，一般只要按照各个条件依次审核，是可以得到最终可信的结果的。但出现假阳性错误，除了污染是一个主要因素外，PCR技术本身的缺陷也是一个重要原因。退火温度设计难以精确，引物的错配及一定程度的单核苷酸错误掺入，都可以导致假阳性结果的产生。而且，要找到其原因并纠正是非常耗时耗力的。所以一个成功的PCR检测方法要经过很长时间的摸索条件和实际验证，才能最终应用于临床，而且在实际操作过程中，对操作的规范要求较高，这也在一定程度上限制了其应用。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种保留了PCR方法高灵敏度、强特异性的特点，又可判断PCR产物中是否存在目的DNA片段的方法。

本发明的目的可通过下述技术方案实现：一种聚合酶链反应与短片段DNA测序相结合的方法，以微量目的基因两端或两侧已知核苷酸序列设计一对引物，以待鉴定DNA作为模板进行扩增(PCR法)，特点是：以PCR产物为模板再次扩增，选取相应检测对象DNA全序列中较保守且特异性较高的几十个甚至几个核苷酸进行短片段DNA测序。克服了现有PCR技术中常出现的假阴性、假阳性现象，提高了精确度。本发明采取PCR方法与短片段DNA测序相结合的方法。一方面保留了PCR方法高灵敏度、强特异性的特点，另一方面应用目前成熟的小片段DNA测序法，只需选取相应检测对象DNA全序列中较保守且特异性较高的几十个甚至几个核苷酸，即可判断PCR产物中是否存在该目的片段，确定阳性或阴性结果。对PCR的操作不再苛求。因为在测序中重新设计引物，以PCR产物为模板再次扩增，使得假阳性率大大降低，所以对PCR试验的条件可以降低要求，如退火温度、循环次数等不再要求得那么严格，大大减少了摸索时间和精力。由于间和精力。由于通过对相关基因的特异区域进行测序，可以确切地知道其具体序列，有利于对该基因进行分型鉴定，并可广泛地应用于各个领域。

在上述技术方案基础上，短片段DNA测序中引物设计是针对与疾病相关且基因序列已知的DNA而设计的。从而使本应用于疾病诊断、物种研究等多学科领域中。