[发明专利]黑曲霉一次发酵生产获得多酶种高酶活复合酶

说明书

本发明属于生物化学和酶工程领域。

饲用酶制剂是饲料添加剂中新崛起的一员。自1975年美国首次使用微生物饲用酶制剂以来已经有了长足的发展。饲用酶制剂的开发和应用是生物技术在动物营养和饲料工业中应用最成功的例子，它在提高动物生产性能和饲料饲料利用率，开发新的饲料资源，生产天然、无毒、无残留的天然畜产品以及环境保护等多方面，逐渐显示出巨大的潜力。发达国家的饲料已有80％以上使用了酶制剂。我国饲料工业起步晚，但发展很快，年产约7000万吨，市场空间很大。

目前国外生产饲用复合酶制剂以及国内少数单位是以液体深层发酵几种单纯酶制剂按一定配方复配、稀释而成，酶系不全，成本高，难以满足饲料成分复杂的需要。

本发明的目的，就是提供生产成本低、产品的酶系全、酶活高、符合环保要求的绿色饲料添加剂的方法。

本发明的优点：

1.采用经诱变筛选获得的优秀黑曲霉单一菌种(Aspergillus niger

  HQ978)；保藏号为CGMCC NO：0696。保藏单位：中国微生

  物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点：中国、北

  京、中关村，保藏时间：2002年1月23日。

2.应用固体发酵机厚层通风发酵，该机具有自动调温、摊括、翻

  料、出料以及无菌加湿设备；不具备发酵机时也可用浅盘发酵

  方式生产。

3.发酵培养基是以麸皮、豆粕为主体和少量无机盐，其原料来源

  广、价格较低的农副产品，生产成本较低；

4.一次发酵即可获得多酶种，高酶活的发酵曲料，经低温烘干、

  粉碎，制备出复合酶饲料添加剂；

5.生产过程不产生废水废渣，造成二次环境污染。

  具体实施步骤：

一、菌种制备

菌种为黑曲霉HQ978。保藏号为CGMCC NO：0696菌种制备分为一、二、三级菌种制备：

1.一级菌种  培养基为常规马铃薯蔗糖琼脂斜面，划线法接种，28±1℃培养96～120h，

2.二级菌种  培养基为麸皮和豆粕，(8∶2)，每个300ml玻璃瓶装10g。料∶水为1∶0.6，121℃灭菌30min，冷却，接入一级种孢子悬液，每瓶5ml，28±1℃培养72～74h。

3.三级菌种  培养基同二级。方法同本公司发明专利“微生物菌种扩大培养的简易容器”，即，每个22×30cm的聚丙烯塑料袋装入经润水的培养基90g，121℃灭菌30min，冷却，接入二级种子孢子悬液，每袋15ml，29～30℃恒温培养，24h倒袋一次，即将结块抖捏成小块，继续培养；48～60h各翻袋一次。一般培养72～75h，大量黑孢子成熟，即可供发酵生产使用或冷藏备用。

二、发酵生产

1.发酵机  固体通风发酵机，每次投料(干基计)1000kg。

2.发酵培养基配制  培养基为麸皮60～80％，豆粕15～35％，硫酸铵3～4％，磷酸二氢钾1～2％，自然PH，先将麸皮和豆粕拌匀，把硫酸铵和磷酸二氢钾溶入相当于干料70％的自来水中，均匀喷入物料中，高压灭菌40～50min，冷却备用。

3.接种  以相当于培养基干料50％的无菌水洗涤60～80袋的三级菌种(相当于干料0.3～0.8％)的孢子，均匀喷入灭菌过的发醇培养基。

4.发酵  将接好菌种的物料投入经过空罐灭菌的发酵罐进行培养。设定温度29～30℃，一般培养至24h左右，菌体生长良好结块，进行第一次翻料，以后视菌体生长结块情况而进行第二、三次翻料，以保持3～5cm的团块为宜。在第一、二次翻料时，若水分＜30％时可酌情喷入无菌水，有利于产酶，发酵时间一般控制在60～62h结束发酵。

三、烘干和粉碎

出罐后，曲料经破碎机破碎，低温烘干，一般＜45℃烘干到物料含水分8～10％即可，然后粉碎，检测，得成品。产品的酶种和酶活单位：酸性蛋白酶10000～11000u/g、纤维素酶18000～20000u/g、木聚糖酶60000～80000u/g、β-葡聚糖酶50000～60000u/g、果胶酶18000～20000u/g、以及淀粉酶、植酸酶等。