[发明专利]通过发酵制备O－乙酰基－L－丝氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及通过发酵制备O-乙酰基-L-丝氨酸的方法。

背景技术

目前用于制备氨基酸的发酵方法极为平常。特别地，这些方法是用以制备二十种蛋白原氨基酸的代表的方法，从经济角度而言，它们高度相关，如L-谷氨酸、L-赖氨酸和L-苏氨酸。但是，有关占有每年1000至10000吨的较小市场的蛋白原氨基酸，如L-苯丙氨酸及L-半胱氨酸的制备方法的报道日益增多。

相反，几乎不知道任何用于制备二十种蛋白原氨基酸生物合成前体的相应的方法。但是，正是这些前体能够代表令人感兴趣的产物，因为它们经常具有手性中心，且可以用作合成药物活性化合物的结构单元。举例言之，专利申请WO 00/44923描述了莽草酸的制备，莽草酸是芳族氨基酸生物合成中的中间体。另一实例是专利申请EP 0994190 A2，其中报道了利用发酵制备L-高丝氨酸，其是L-甲硫氨酸的前体。

O-乙酰基-L-丝氨酸是L-半胱氨酸的生物合成前体。其本身也是氨基酸，且通过L-丝氨酸在羟基官能团乙酰化而在细菌和植物代谢中形成。该反应通过酶丝氨酸O-乙酰基转移酶[EC 2.3.1.30]催化，该酶由cysE基因编码。在细胞中，O-乙酰基丝氨酸经历进一步反应，形成L-半胱氨酸。在该反应中，乙酸官能基由硫醇官能基取代。

通过发酵制备O-乙酰基-L-丝氨酸的问题源自以下事实，即，在pH值大于4.0时，该物质极不稳定且异构化为N-乙酰基-L-丝氨酸。在pH7.6时，反应速率为1％×min^-1(Tai等，1995，Biochemistry 34：12311-12322)。这意谓在通常进行至少一天半的发酵后，在这些条件下无法检测到显著量的O-乙酰基丝氨酸。异构化反应不可逆，且其速率随pH增加仍进一步增加。与O-乙酰基-L-丝氨酸相反，N-乙酰基-L-丝氨酸因其氨基官能基被封阻而不再能用于肽合成。

另一问题是，O-乙酰基-L-丝氨酸在细胞中的水平极低，且经受强力调节。一方面，丝氨酸乙酰基转移酶受到L-半胱氨酸的变构抑制，因此在有μM浓度的L-半胱氨酸的存在下，O-乙酰基-L-丝氨酸的合成不可能。另一方面，异构化产物N-乙酰基-L-丝氨酸起硫调节子的诱导物的作用，因而导致O-乙酰基-L-丝氨酸与硫化物快速反应形成L-半胱氨酸。

Dassler等(2000，Mol.Microbiol.36：1101-1112)曾报道，超量生产膜蛋白ydeD(＝Orf299)的细胞向培养基中分泌L-半胱氨酸、2-甲基噻唑烷-2，4-二羧酸及O-乙酰基-L-丝氨酸。但是，仅可能检测出极少量，0.12g/l的O-乙酰基-L-丝氨酸，且仅在摇瓶试验中检测到。另一方面，在由于改善营养供应而能得到更高收率的发酵试验中仅得到N-乙酰基-L-丝氨酸。已经讨论过O-乙酰基-L-丝氨酸仅在pH为4-5时足够稳定的可能性。但是，由于嗜中性细菌如大肠杆菌的不良生长，所以该pH范围不适于发酵制备。

在专利申请EP 0885962 A1描述了使用Orf299在pH7.0发酵制备N-乙酰基-L-丝氨酸。在此案中，Orf299基因(在该申请中命名为SEQ.ID.NO：3)与适当的cysE等位基因结合。这些等位基因编码丝氨酸乙酰基转移酶，该乙酰基转移酶经历较少的L-半胱氨酸的反馈抑制。这导致实现细胞中O-乙酰基-L-丝氨酸的产量增加，且最终由于快速异构化导致N-乙酰基-L-丝氨酸的积累。

如专利申请WO 97/15673所述，使用本身经历较少反馈抑制的cysE等位基因也未导致O-乙酰基-L-丝氨酸的积累。尽管使用此方法时，在细胞内实现了O-乙酰基-L-丝氨酸形成的增加，但在细胞外仅检测到L-半胱氨酸，从而作为产物得到。

当制备O-乙酰基-L-丝氨酸时的另一严重问题是由Dassler等(2000，Mol.Microbiol.36：1101-1112)报道的，即Orf299的超量生产导致细菌生长的严重损伤。这是由于因细胞内缺乏诱导物N-乙酰基-L-丝氨酸而造成无硫调节子诱导所致。

发明内容

本发明的目的是提供发酵方法，尽管O-乙酰基-L-丝氨酸不稳定，且O-乙酰基-L-丝氨酸自细胞有效输出产生负面生理结果，所述方法仍提供高的O-乙酰基-L-丝氨酸收率，。

该目的如下实现：在发酵培养基中培养微生物菌株，该微生物菌株衍生自野生型，且与野生型相比，其O-乙酰基-L-丝氨酸内源形成和O-乙酰基-L-丝氨酸流出增加，其中将发酵培养基中的pH调节到5.1至6.5的范围内。

附图说明