[发明专利]探针聚合物制备用探针、探针聚合物的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及具有n(n≥3)个互补碱基序列区域的成对探针聚合物制备用探针、使用该探针的探针聚合物制备方法以及利用该方法检测目标基因的方法。

背景技术

基因工程领域中的DNA解析方法是对新型基因和病原基因的探索、遗传疾病、癌症、感染的诊断等非常有用的方法。作为目标基因的扩增、解析方法，广泛使用聚合酶链式反应方法(PCR法)(USP 4683195，4683202)。作为其它方法，有逆转录PCR法(RT-PCR法、Trends inBiotechnology，10，146-152，1992)、连接酶链式反应(LCR，ligase chainreaction，EP 320308)法等。由于这些方法包括对双链DNA的一条链进行解离、由引物合成互补链等步骤，所以必须反复进行几次高温和低温的反应。因此必须使用严格的温度控制装置，由于设定温度需要时间，即产生了时间上的损失。而且，还必须使用昂贵的酶。

随后，为了解决温度控制的问题，开发了等温条件下的DNA扩增法。例如，链置换型扩增法(SDA，stand displacement amplification，NucleicAcid Res.，20，1691-1696，1992)、核酸序列扩增法(NASBA，nucleic acidsequence based amplification，Nature，350，9-12，1991)、Qβ复制酶法(BioTechnology，6，1197-1202，1988)等。这些方法具有能够在等温条件下实施的优点，但必须使用DNA聚合酶、限制性核酸内切酶等昂贵的酶。

这些等温核酸扩增法在引物的数量和操作方面存在一些问题，因而希望确立采用不使用酶的低成本、简便方法的核酸扩增方法、核酸检测方法。

另一方面，采用分支DNA探针法的基因扩增是通过预先合成支化高分子的单链DNA探针，再使之与目标基因杂交，检测目标基因的方法，为了使支化高分子的单链DNA探针与目标基因杂交，由于分支DNA探针是高分子所以需要花费时间，另外由于支化高分子的分支DNA探针的大小有限度，所以目标基因的检测也有限度。

鉴于上述问题，本发明者已经提出了不使用酶的新型等温核酸扩增法(探针聚合物的制备方法)(EP 1002877A)。该方法是使用由3个区域构成的成对探针(Honey Comb Probe，下面称作HCP)的方法，第1探针与第2探针各自的3个区域具有互补碱基序列，使二者发生反应时，为了仅与1个区域进行杂交，对各个区域的碱基序列进行了钻研。根据这些钻研，在使复数个成对的探针发生反应时，可以相互杂交，使之形成探针聚合物(Probe alternation link self-assembly reaction，下面称作PALSAR法)。

通过利用该申请的探针聚合物的制备方法，可以检测出被测体试样中的目标基因，实现所谓不使用酶等温操作的划时代的、简便且廉价的方法。

发明内容

本发明对上述已经申请的探针聚合物的制备方法进行了进一步的研究，通过将探针聚合物制成更稳定的聚合物，对于该方法的进一步改良进行了尝试。

为了解决上述问题，本发明者进行了悉心的研究，结果在使用复数对由3个以上互补碱基序列区域构成的成对(2个一组)探针，使之杂交达到相互交错的状态，容易在等温条件下形成双链探针聚合物的基础上，发现对于PALSAR法中使用的成对探针，通过使相互交错进行杂交时各个区域中分支点(两端)的碱基序列成为G(鸟嘌呤)与C(胞嘧啶)的结合，由于各区域分支点中碱基对之间的结合力比A(腺嘌呤)与T(胸腺嘧啶)牢固，该区域全部碱基的π电子产生的特殊相互作用比现有的更强，从而完成了本发明。

本发明的目的在于提供一种通过使各区域的分支点中碱基对之间的结合力更加牢固，可以制备更稳定地探针聚合物，同时能够不使用核酸合成酶和支化DNA，在等温条件下高效率地使探针聚合形成探针聚合物，而且，由于形成的聚合物的碱基堆积形成规则的高次结构，表现出260nm处紫外吸收带强度减弱的所谓“减色性”的减色效应，可以确认聚合物状态，进而，在聚合物的碱基堆积之间插入廉价的荧光物质，根据其荧光强度的变化可以确认聚合物的状态，从而可以进行迄今为止尚未有过的低成本而且简便的基因检测的探针聚合物制备用探针、使用该探针的探针聚合物的制备方法、采用该方法制备的探针聚合物、使用该探针聚合物测定目标基因的方法以及目标基因的检测试剂。

本发明的探针聚合物制备用探针的第1种方式含有具备下述(a)(b)(c)特性的成对的第1探针和第2探针。