[发明专利]通过同时测量至少两种不同分子标记物来提高检测肿瘤及其前体阶段时的临床特异性的方法

说明书

背景技术

癌性疾病仍然是全球最常见的致死原因之一。临床上存在对癌症和癌前期的早期识别和特定检测方法的需求。此外，肿瘤的更详尽的特征描述至关重要，以便得出有关治疗和预后的推论。这是有效的，因为不同的癌症亚型对所施用的治疗措施产生相异的反应。因此，譬如，当被怀疑为乳腺癌时，会更加频繁地求助于对分子标记物的免疫组织化学染色，例如细胞角蛋白、雌激素受体、her2/neu、Ki67或p53(例如Leek等，1994，Br.J.Cancer，69，135-139；Mokbel等，1999，Am.J.Surgery，178，69-72；Reiner等，1990，Cancer，Res.，50，7057-7061)。而这些染色常常通过乳腺活组织检查进行，通过针穿刺(FNA＝细针吸活检)进行染色也日益增多。分子标记物也用于有关判定肿瘤是否是原发性肿瘤或转移中。例如，对原发性感染器官特异性的标记物的表达可以有助于这种鉴定。

近年来，业已鉴定了大量的基因，作为突变的结果，它们以变化了的方式表达其蛋白，因而在癌的发生中起了作用。作为诊断标记物，可以在血清和细胞水平检测到相应的蛋白质。这些蛋白质参与细胞中多样性的生理调节过程，例如生长调控(增殖基因，例如Ki67和mcm-5；致癌基因和肿瘤抑制基因，例如p16、EGF受体、her2/neu和mdm-2)、细胞凋亡(自然细胞死亡，例如p53和bcl-2)、DNA修复(msh-1)和细胞粘着(E-钙粘着蛋白、β-连环蛋白和APC)。譬如，试验对抗上述蛋白质的特异性抗体的免疫组织化学和免疫细胞化学检测方法适合这样的检测(van Noorden，1986，Immunocytochemistry，Modern Methods and Applications，2nd edition，Wright，Bristol，26-53)。

已经多次证实单一标记物不足以获得有关识别病变细胞的特异性，因为它存在于一些健康细胞中。这所基于的事实是，这些标记物可以是参与健康细胞中的生理调节过程且只被过分高度表达的蛋白质，所述的过分高度表达是病变细胞的一个指征。Williams等(1998，PNAS，95，14932-14937)描述了DNA复制标记物mcm-5，其检测出子宫颈涂片的28种试验损伤/肿瘤(n＝58)，但在这28种正常涂片中也提供2种错误的阳性染色。Sano等(Pathology Intl.，1998，48，580-585)报导了标记物p16在15种正常宫颈活组织中的3种非特异染色。虽然事实上可以在子宫颈的100％的全部损伤和肿瘤中检测到HPV，但也可以在许多正常子宫颈上皮中检测到HPV；即，虽然检测HPV的试验高度敏感，但它只具有低的特异性(例如Cuzick，2000，JAMA.283，108-109)。

在病理学中，人们对检测生物样本中多种标记物日益感兴趣。一方面，这能够获得更多有关检测和定性病变细胞或组织区域的可利用信息；另一方面，可以识别出各个标记物的非特异染色是什么并且由此避免不正确结论。传统上，出于这种目的制备了可利用活组织的连续切片或机体样本的多种标本(例如宫颈涂片在固定剂中)，随后其分别用特定标记物染色。这种方法存在若干缺点：患者样本材料的高度耗费，而样本材料通常是有限的；染色试剂的高度消耗；需要大量的时间且成本较高；而且也不可能在细胞或组织样本的特定区域中同时清晰地探测出两种或多种标记物。虽然文献中业已报导了在生物样本中两种或多种不同生物标记物的同时检测(DAKO，免疫酶双染色法实践指南；Gomez等，Eur J.Histochem.，1997.41，255-259)，但该途径至今无法应用到常规诊断中，因为这些方案在任何程度上都无法标准化。Terhavauta等人(Cytopathology，1994，5.282-293)采用p53和Ki67在取自子宫颈损伤的活组织中的双重染色，并且在一个细胞的某些情况中可以由HPV阳性和HPV阴性损伤衍生的基细胞和副基细胞中检测到这两种标记物。然而，同时，作者没有利用由上述双重染色所获得的信息，通过合并所得的结果，来描绘出有关这个样本中肿瘤细胞存在的可靠结论。完全没有任何从自动检测肿瘤区域的立场出发利用染色信息的尝试。而且，除了这种联合之外，没有提及任何其它可能有利于肿瘤区域的鉴定和定性的标记物联合物。