[发明专利]生产促胰岛素分泌肽GLP－1(7－36)的基因工程菌以及生产GLP－1(7－36)的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生产促胰岛素分泌肽GLP-1(7-36)(Glucagon LikePeptide，胰高血糖素类多肽)的基因工程菌和利用该基因工程菌发酵生产GLP-1(7-36)的方法。GLP-1(7-36)是可能作为II型糖尿病治疗药物的一种活性多肽。

背景技术

GLP-1是人体分泌的一种肠道激素，由胰高血糖素原(Proglucagon)分子经肠道蛋白水解酶作用而产生，因而称为胰高血糖素类多肽。当血糖浓度高于6mmol/L时，GLP-1能显著促进胰岛素分泌；而一旦血糖浓度恢复至正常值则不再继续作用，这一点对II型糖尿病的治疗十分有用(中国专利公开号CN 1129224A)。

人体内的GLP-1有二种形式，一种为GLP-1(7-36)NH₂，是由30个氨基酸残基组成的多肽，其C端是酰胺化了的；另一种为GLP-1(7-37)，是由31个氨基酸残基组成的多肽。GLP-1(7-36)NH₂和GLP-1(7-37)有相同的促胰岛素分泌作用，例如实验证明，在1×10^-10～1×10^-11mol/L浓度下，GLP-1对离体胰岛细胞作用时，促进了胰岛素的分泌，故又称它们为促胰岛素分泌肽。

中国专利公开CN 1129224A说明书第32页报道，与上述二种促胰岛素分泌肽一样，GLP-1(7-36)也具有促胰岛素分泌作用。

已经有报道通过基因工程方法来生产GLP-1(7-36)NH₂，但还没有研究者尝试用基因工程技术生产GLP-1(7-36)。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是构建用于生产GLP-1(7-36)的一系列基因工程菌株，以及利用这些菌株生产GLP-1(7-36)的方法。应用本发明提供的基因工程菌以及相应的方法，能够大规模低成本地生产GLP-1(7-36)。

GLP-1(7-36)的氨基酸序列如下：

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg

式中英文缩写表示：His组氨酸，Ala丙氨酸，Glu谷氨酸，Gly甘氨酸，Thr苏氨酸，Phe苯丙氨酸，Ser丝氨酸，Asp天冬氨酸，Val缬氨酸，Tyr酪氨酸，Leu亮氨酸，Gln谷氨酰胺，Lys赖氨酸，Trp色氨酸，Ile异亮氨酸，Arg精氨酸

本发明是通过以下技术方案来实现的。

本发明提供的生产促胰岛素分泌肽GLP-1(7-36)的基因工程菌，该菌属大肠杆菌(Escherichia coli)，保藏在北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2001年7月11日，保藏号为CGMCC No.0599。该基因工程菌携带的质粒中包含有表达GLP-1(7-36)的基因，宿主细胞为大肠杆菌。

本发明提供的生产促胰岛素分泌肽GLP-1(7-36)的基因工程菌，其携带的质粒中包含有n个表达GLP-1(7-36)的基因，其中，n为从1到32的整数。

本发明提供的生产促胰岛素分泌肽GLP-1(7-36)的基因工程菌，优选例为：其携带的质粒中包含有16个表达GLP-1(7-36)的基因。

本发明提供的生产促胰岛素分泌肽GLP-1(7-36)的基因工程菌，其宿主细胞大肠杆菌为JM103，JM109或DH₅α。

本发明提供的生产促胰岛素分泌肽GLP-1(7-36)的基因工程菌，携带的质粒的启动子为Lac，P_L，Tac，P_T7或Trp。

本发明的基因工程菌的构建方法，包括将n个表达GLP-1(7-36)的基因克隆于质粒中，并将质粒转化到宿主细胞大肠杆菌中，其中，n为从1到32的整数。

本发明的基因工程菌的构建方法中，所述的宿主细胞大肠杆菌为JM103，JM109或DH₅α。

本发明的基因工程菌的构建方法中，所述的质粒的启动子为Lac，P_L，Tac，P_T7或Trp。