[发明专利]具有高度延伸专一性的DNA低温循环延伸反应方法

说明书

本发明涉及生物工程，更具体地说涉及DNA低温循环延伸反应。

一般加热到95℃(高于其变性温度Tm)时，双链DNA就会变性，产生两条互补的单链DNA片断。在酶促DNA聚合反应时，当引物结合到单链模板中的互补序列上后，会延伸产生新的DNA链。重新加热到95℃时，新合成的DNA将和模板分离。单链模板在退火后又可与寡核苷酸引物结合，在有足够活性的DNA聚合酶和四种dNTP的存在下，新一轮的酶促DNA聚合反应得以进行。上述反应通常选用热稳定的DNA聚合酶一它能经受95℃的高温，并在55-72℃时有聚合活性。这样在每次高温变性之后不必加入额外的聚合酶。当一种过量的引物和模板混和，经过若干次温度循环后，单链DNA靶片断的数目将以每次循环增加一倍的速度扩增。当反应体系中存在链终止物，即四种ddNTP(包括ddATP、ddCTP、ddGTP和ddTTP)或其类似物时，将产生许多长短不同的单链DNA片断。这些片断的5’端有相同的引物，3’端为特定的ddNTP或其类似物，ddNTP类似物可用荧光染料标记。以上就是利用荧光染料标记的DNA链终止物进行自动DNA测序的原理。

在上述体系中加入一对引物，即一个正向引物和一个反向引物，它们分别与双链DNA靶序列的两端互补，这样，新合成的DNA链可作为后续聚合反应的模板。当热循环重复若干次时，靶片断的拷贝数呈指数增长。以上就是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)的原理。

实际操作时，不管是PCR反应，还是利用荧光染料标记的DNA链终止物进行自动DNA测序，都使用热稳定的DNA聚合酶，比如栖热水生菌(Thermusaquaticus)DNA聚合酶(Taq)，它能承受95℃的高温。但热稳定聚合酶通常进行性较低，而且在某些条件下，特别是在待扩增或测序DNA模板存在GC富含区时，会丧失其序列特异的聚合酶活性。因此，有人尝试用热不稳定DNA聚合酶进行低温循环测序反应(Fuller)和低温PCR反应(Iakobashvili和Lapidot)，热不稳定DNA聚合酶一般比热稳定DNA聚合酶有更高的忠实性和进行性。Fuller声称终浓度为40％(v/v)甘油或乙二醇可降低模板DNA的Tm值，使变性和延伸反应得以在80℃以下进行，从而可以使用包括Bca和Klenow片断的DNA聚合酶进行扩增反应。同时，Iakobashvili和Lapidot发现即使在高浓度的甘油下，Klenow片段仍不适合低温循环引物延伸反应。但是如果反应在37℃-70℃进行，在反应体系中加入4.85M脯氨酸和17％(w/v)甘油，可以保护Klenow片断的活性。然而，不管是Fuller还是Iakobashvili和Lapidot的低温PCR方法，都没有投入实际应用，也没有迹象表明它们能产生高质量的序列特异PCR产物，或者可以产生适合测序的反应产物。Iakobashvili和Lapidot并没有证实低温PCR产物是序列特异的，特别是使用20-25bp长的引物时。即使当引物长度为30-35bp时，Klenow片段可获得低温PCR产物，但也没有证据表明其序列特异性。由于大多数用于PCR或测序反应的引物小于30bp，所以迫切需要找到一种低温DNA扩增体系，使得使用短于20bp的引物能得到有用的特异性产物，以供测序或其他进一步分析之需。

本发明的目的是提供一种低温DNA扩增体系，使该体系能使用短于25bp的引物能得到有用的特异性产物，以供测序或其他分析之需。

本发明另一目的是提供稳定的即用反应预混和物，它可用于大规模高保真PCR和自动荧光DNA循环测序反应。

本发明是这样实现的，一种延伸专一性的DNA低温循环延伸方法包括：

a.在反应体系中含有低浓度的甘油或乙二醇，存在有一种模板，一对长度短于或长于25bp的引物和一种野生型或修饰后的中等热稳定DNA聚合酶的即用型反应混合物，当温度在变性温度(～70℃)和退火温度(约37℃)之间循环时DNA聚合酶能重复延伸引物，得到序列特异性扩增产物；

b.扩增双链DNA片断直接用于循环测序反应，该循环测序反应包括加入大大过量引物、四种标准荧光标记的ddNTP终止物、一种中等热稳定的DNA聚合酶、适量四种ddNTP混合物及含有15％(V/V)甘油的缓冲体系，在80℃以下重复环引物延伸反应若干次，得荧光标记ddNTP终止的不同长度延伸产物；

反应在甘油的浓度为5-35％，最适浓度为15％的溶液中进行；