[发明专利]具有高度延伸专一性的DNA低温循环延伸反应方法

权利要求书

1.一种延伸专一性的DNA低温循环延伸方法包括

a.在反应体系中含有低浓度的甘油或乙二醇，存在有一种模板，一对长度短于或长于25bp的引物和一种野生型或修饰后的中等热稳定DNA聚合酶的即用型反应混合物，当温度在变性温度(~70℃)和退火温度(约37℃)之间循环时DNA聚合酶能重复延伸引物，得到序列特异性扩增产物；

b.扩增双链DNA片断直接用于循环测序反应，该循环测序反应包括加入大大过量引物、四种标准荧光标记的ddNTP终止物、一种中等热稳定的DNA聚合酶、适量四种ddNTP混合物及含有15％(V/V)甘油的缓冲体系，在80℃以下重复环引物延伸反应若干次，得荧光标记ddNTP终止的不同长度延伸产物。

2、根据权利要求1所述的延伸专一性的DNA低温循环延伸方法，其特征在于反应在甘油的浓度为5-35％，最适浓度为15％的溶液中进行。

3、根据权利要求1所述的延伸专一性的DNA低温循环延伸方法，其特征在于中等热稳定DNA聚合酶反应温度为37℃-70℃，最适反应温度为65±1℃。

4、根据权利要求1所述的延伸专一性的DNA低温循环延伸方法，其特征在于中等热稳定DNA聚合酶与Bacillus stearothermophilus、Bacillus caldotenax或Bacillus caldolyticus的聚合酶的氨基酸至少存在95％同源性。

5、根据权利要求1所述的延伸专一性的DNA低温循环延伸方法，其特征在于正向引物和反向引物的长度可短于或长于25bp。

6、根据权利要求1所述的延伸专一性的DNA低温循环延伸方法，其特征在于反应体系中重复热循环多次，双链DNA的指定区域得到扩增。

7、根据权利要求1所述的延伸专一性的DNA低温循环延伸方法，其特征在于反应体系中存在ddNTP或其类似物时，用单一引物重复扩增，得不同长度的特异性延伸终止。

8、根据权利要求1b所述的延伸专一性的DNA低温循环延伸方法，其特征在于中等热稳定DNA聚合酶可为野生型或修饰后的源自Bacillusstearothermophilus、Bacillus caldotenax或Bacillus caldolyticus DNA聚合酶，或者氨基酸序列与Bacillus stearothermophilus、Bacilluscaldotenax或Bacillus caldolyticus的聚合酶的氨基酸序列至少95％同源的中等热稳定DNA聚合酶。

9、根据权利要求1a所述的延伸专一性的DNA低温循环延伸方法，其特征在于即用反应混和物含有一种中等热稳定DNA聚合酶，它与一部分或所有与酶促DNA引物延伸反应有关的成分预先混合，在80℃以下进行低温循环引物延伸反应或含有ddNTP类似物的特异延伸终止反应。

10、根据权利要求1a所述的延伸专一性的DNA低温循环延伸方法，其特征在于即用反应混和物中中等稳定DNA聚合酶可为野生型或修饰后源自Bacillus stearothermophilus、Bacillus caldotenax或Bacilluscaldolyticus的DNA聚合酶，或者氨基酸序列与Bacillusstearothermophilus、Bacillus caldotenax或Bacillus caldolyticus的DNA聚合酶的氨基酸序列至少存在95％同源的中等热稳定DNA聚合酶。

11、根据权利要求1a所述的延伸专一性的DNA低温循环延伸方法，其特征在于即用反应混和物为干粉或预先配制的溶液。

12、根据权利要求1a所述的延伸专一性的DNA低温循环延伸方法，其特征在于即用混和物预先分装在微离心管或多孔反应板中。

13、如权利要求1a即用型混和物用于大规模自动PCR扩增或大规模自动DNA测序反应。