[发明专利]棉铃虫增效蛋白基因工程菌株的构建及其增效蛋白的表达

说明书

本发明涉及在大肠杆菌中表达棉铃虫颗粒体病毒(HaGV)增效蛋白，含有HaGV增效蛋白的基因的表达载体，在大肠杆菌中表达HaGV增效蛋白的方法。

目前，已在9种颗粒体病毒、舞毒蛾(Lymantria dispar)NPV和4种痘病毒中发现了昆虫病毒增效蛋白(enhancin)^[1.2]。昆虫病毒增效蛋白是病毒基因编码的一种金属蛋白酶，分子量为89-10KD，具有一个典型的金属蛋白酶锌-结合域HEXXH，位置十分保守，且对中肠围食膜的降解作用受到金属螯合剂的抑制。^[3.4]

昆虫病毒增效蛋白可以提高昆虫的敏感性，加速核型多角体病毒NPV的感染进程，^[5]同时能提高苏云金杆菌伴孢晶体对幼虫的毒力。^[6]增效蛋白的作用机制有二种：一种是增效蛋白能与中肠细胞膜上的特异位点结合，介导病毒囊膜与细胞质膜之间的融合，促进杆状病毒进入宿主细胞内，从而增加病毒感染的效果。^[7-9]但增效蛋白与中肠细胞膜上的特异位点结合并不是增进病毒感染所必需的。^[10，11]另一种机制是增效蛋白通过降解肠粘蛋白IIM而破坏昆虫幼虫中肠围食膜，使病毒粒子更容易进入中肠细胞，同时提高了某些必须穿透围食膜而发生作用的生物杀虫剂的效能。

目前，昆虫病毒增效蛋白实施的基因工程主要有三种方式：1.将增效蛋白基因重组在AcMNPV等广谱高效的病毒中，构建含增效蛋白基因的重组AcMNPV。2.构建含增效蛋白基因的转基因植物，提高害虫对NPV的敏感性。3.在原核细胞中表达增效蛋白。表达产物形成包涵体晶体，稳定且易纯化。

本发明的目的是提供一种新型的含有HaGV增效蛋白基因的工程菌株、该菌株的构建方法，以及利用该菌株生产增效蛋白的方法。该工程菌株含有HaGV增效蛋白的基因的表达载体，并能有效表达HaGV增效蛋白。该工程菌株命名为Escherichia coli M15(pEHa)，已于2000年4月11同保藏于中国典型培养物保藏中心，登记入册号为CCTCC NO：M 201010，该载体由下列DNA元件组成。

(1)棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白基因3′端2.1Kb片段。

(2)大肠杆菌质粒复制起始点。

(3)氨卡青霉素抗性基因。

(4)6个连续组氨酸编码区。

本发明用于构建HaGV增效蛋白的工程菌株的原材料有如下几种：

(1)HaGV，由美国汤姆·杰弗逊大学微生物学及免疫学系Zailin Yu博士赠送。

(2)pQE-30、E.coli M15(pREP4)，购自QIAGEN公司。

(3)T₄DNA连接酶购自华美生物技术公司。

采用基因工程方法构建含HaGV增效蛋白基因的工程菌株，方法如下：1.HaGV增效蛋白基因的扩增(1)HaGV DNA的提取

取HaGV悬液100ul，加等体积0.04mol/L NaOH碱解液及终浓渡为1％SDS，56℃水浴处理10分钟，待悬液半透明后，用碱性酚、氯仿，异戊醇(25∶24∶1)、氯仿∶异戊醇(24∶1)混合液抽提HaGV DNA各一次，用预冷无水乙醇沉淀DNA，-20℃放置过夜，离心后用75％乙醇洗，干燥沉淀，将DNA溶于TE(10mMTris.1mMEDTA pH8.0)缓冲液中，-20℃保存。(2)HaGV增效蛋白基因的PCR扩增设计引物如下：

P₁：5′TGAATGTTCGTTTGCTCTCGCGTTGTT 3′

P₂：5′ATACTGCAGTGTTCTCCCACTACTAAT 3′

上述引物由上海生工公司合成。按B.M.公司Taq DNA Polymerase试剂(从栖热水生菌YT-1中提纯得到的耐热DNA多聚酶)操作手册，依次加入：

①10×PCR反应缓冲液10μl；

②两种引物各2μl；

③10mol/L dNTPs 2μl；

④Taq DNA Polymerase(5U/μl)1μl；

⑤补去离子水至100μl反应体积；

⑥加石蜡油覆盖液面。