[发明专利]棉铃虫增效蛋白基因工程菌株的构建及其增效蛋白的表达

权利要求书

1.一种工程菌株Escherichia coli M15(pEHa)，该工程菌株已提交中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为：CCTCC NO：M 201010

2.根据权利要求所述的工程菌株，其特征在于它含有重组质粒pEHa由下列DNA元件构成。

(1)棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白基因3’端2.1Kb片段。

(2)大肠杆菌质粒复制起始点。

(3)氨苄青霉素抗性基因。

(4)六个连续组氨酸编码区。

3.根据权利要求所述的工程菌株，其特征在于：该工程菌株携带棉铃虫颗粒体病毒N未端截短增效蛋白的基因，具有卡那霉素和氨苄青霉素抗性基因，能够使HaGV增效蛋白在大肠杆菌中获得表达。

4.一种构建权利要求1-4所述的工程菌株的方法，其特征在于：用SacI、Pst I分别双酶切质粒pQE和PCR法扩增的2.1Kb HaGV增效蛋白基因片段，用T4 DNA连接酶连接、转化感受态细胞E.coli M15，经氨苄霉素和卡那霉素双抗平板筛选，获得Escherichia coli M15(pEHa)的工程菌株。

5.一种构建权利要求1-3所述工程菌株的方法。其特征在于：以HaGV基因组DNA为模板，设计引物：P_1：5′TGAATGTTCGTTTGCTCTCGCGTTGTT 3′P_2：5′ATACTGCAGTGTTCTCCCACTACTAAT 3′

PCR法扩增棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白基因，获得2.1Kb HaGV N端截短的增效蛋白基因片段。

6.一种利用权利要求1、2、3、4、5所述的工程菌株生产HaGV增效蛋白的方法。其特征在于将工程菌株CCTCC NO：M 201010单菌落挑到含100μg/ml的的氨苄青霉素和25μg/ml卡那霉素的2YT培养基中，37℃，200rpm过夜培养，次日以1∶4比例接种到含上述双抗的500ml2YT培养基中，当其浓度达计OD600＝0.3时，加入异丙基-β-D-硫代单乳糖苷至终浓渡1mM，于37℃，200rpm诱导表达5h，收获菌液，4000rpm离心10min，收集菌体沉淀，再按常规方法获得表达的HaGV增效蛋白。