[发明专利]仔猪大肠杆菌K88ac－ST1－LTB三价基因工程菌苗及制备方法

说明书

本发明涉及基因片段突变，在表达载体pXKST3LT5中引入大肠杆菌K88ac-ST₁-LT_B融合基因的仔猪大肠杆菌K88ac-ST₁-LT_B三价基因工程菌苗及制备方法。

引起仔猪黄、白痢的致病菌为产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)，其致病因子主要为菌毛和菌体产生的肠毒素—耐热性肠毒素和不耐热性肠毒素，耐热性肠毒素分为ST₁和ST₂，ST₁是最主要的直接致病因子，不耐热性肠毒素由毒性亚单位LT_A和结合亚单位LT_B组成。目前，市场上流行的菌苗为传统的灭活菌、K88-K99和K88-LT_B基因工程菌苗，这2类菌苗存在的主要问题，一是没有解决导致仔猪黄、白痢的最主要致病因子ST₁的抗原性，二是现有菌苗针对的致病ETEC血清型范围较小。正是由于现有菌苗未能解决上述问题，故免疫效果不十分理想，常常导致免疫失败，致使仔猪发病，甚至导致死亡。

本发明的目的是提供一种克服上述缺点，菌苗抗原成份能达到缓慢释放、能更有效地预防仔猪黄、白痢的仔猪大肠杆菌K88ac-ST₁-LT_B三价基因工程菌苗及制备方法。

本发明的这种新型基因工程菌苗，K88ac-ST₁-LT_B融合基因表达质粒pXKST3LT5的结构式：-Ori--P_T7--K88ac gene--ST₁-ST₁-ST₁gene--LT_B gene--Kangene--，

菌苗的构建方法：采用聚合酶链反应(PCR)、基因突变和基因重组技术，从大肠杆菌C83902质粒中扩增出K88ac、ST₁和LT_B基因，通过分离、纯化、内切酶酶切，获得了K88ac、ST₁和LT_B基因，通过连接反应，将3个ST₁突变基因串联在一起，再将K88ac抗原基因融合在3个ST₁突变基因的上游，然后将已构建的K88ac-ST₁-ST₁-ST₁融合基因融合在LT_B抗原基因的上游，最后，将构建的K88ac-ST₁-LT_B融合基因插入到表达载体pET-28b中，构建了重组质粒pXKST3LT5，通过氯化钙转化法转入到受体菌BL21(DE3)中，构建了含K88ac-ST₁-LT_B融合基因表达载体的基因工程菌株BL21(DE3)(pXKST3LT5)。该基因工程菌株经发酵培养后，用0.4％甲醛灭活，并辅以氢氧化铝胶制成基因工程菌苗。

本发明方法构建的ST₁基因为3｀端含有2个编码半胱氨酸残基Cys的TGT被突变成编码丝氨酸残基Ser的AGT的突变基因，3个串联在一起的ST₁突变基因所表达的ST₁突变肠毒素已失去了ST₁肠毒素本身的生物学毒性；因为ST₁肠毒素本身含有6个半胱氨酸残基Cys，这六个cys可形成3对链内二硫键，这3对二硫键对ST₁具有生物学毒性至关重要，如果将二硫键破坏，就可以使ST₁失去生物学毒性。根据ST₁这一理化性质，在基因水平上将编码Cys的TGT突变成编Ser的AGT，这样的ST₁突变基因的表达产物就失去了2个链内二硫键，结果导致ST₁突变体不具有ST₁生物学毒性，从而可用于研制基因工程菌苗的目的。