[发明专利]仔猪大肠杆菌K88ac－ST1－LTB三价基因工程菌苗及制备方法

权利要求书

1.一种用于预防仔猪大肠杆菌腹泻的K88ac-ST₁-LT_B三价基因工程菌苗，其特征是基因工程菌株BL21(DE3)(pXKST3LT5)：

1)受体菌为大肠杆菌BL21(DE3)

2)重组表达质粒pXKST3LT5-Ori--P_T7--K88ac gene--ST₁-ST₁-ST₁ gene--LT_B gene--Kangene--

它含有大肠杆菌复制子Ori，P_T7是T7 RNA聚合酶/启动子表达系统，受体菌BL21(DE3)，外源目的基因为K88ac、ST₁和LT_B基因，抗性筛选基因为卡那霉素Kan基因；K88ac保护性抗原基因是K88ac全基因的第250位至第579位，该基因表达的抗原包含了K88ac全抗原的绝大部分抗原决定簇；ST₁基因为3｀端含有2个编码半胱氨酸残基Cys的TGT被突变成编码丝氨酸残基Ser的AGT的突变基因，串联在一起的3个ST₁突变基因所表达的ST₁突变肠毒素已失去了ST₁肠毒素本身的生物学毒性；LT_B抗原基因为具有良好的抗原性的全基因，基因工程菌株BL21(DE3)(pXKST3LT5)表达的有效抗原K88ac-ST₁-LT_B融合蛋白以包含体形式存在于菌体内部，且K88ac和LT_B在保留原有抗原性基础上，赋予了原本不具有抗原性的ST₁具有了抗原性。

2.一种仔猪大肠杆菌K88ac-ST₁-LT_B三价基因工程菌苗的构建方法，采用聚合酶链反应、基因突变和基因重组技术，其特征是：1、设计并合成了3对ST₁聚合酶链反应引物：上游引物P1：5｀-CCCAAGCTTAACAACACATTTTACTGC3｀，P2：5｀GGAATTCCATATGAACAACACATTTTACTGC-3｀，P3：5｀-CCGGAATTCAACAACACATTTTACTGC-3｀，下游引物P4：5｀GGAATTCCATATGATAACTTCCAGCACTGGC3｀，P5：5｀CCGGAATTCATAACTTCCAGCACTGGC-3｀，P6：5｀-CGCGGATCCATAACTTCCAGCACTGGC-3｀，其中P1、P2、P3引物中分别含有HindIII、NdeI、EcoRI酶切位点，P4、P5、P6引物中分别含有NdeI、EcoRI、BamHI酶切位点，且P4_P6引物中含有的ST₁基因是将3｀端含有2个编码半胱氨酸残基Cys的TGT被突变成编码丝氨酸残基Ser的AGT的突变基因；上游引物分别与下游引物组合：P1和P4为1对引物，P2和P5为1对引物，P3和P6为1对引物，然后用这3对引物分别从大肠杆菌C83902质粒中扩增出3个ST₁突变基因，P1和P4引物扩增的产物用HindIII和NdeI双酶切，P2和P5引物扩增的产物用NdeI和EcoRI双酶切，P3和P6引物扩增的产物用EcoRI和BamHI双酶切，然后分别通过3％琼脂糖凝胶电泳分离、纯化双酶切的聚合酶链反应产物即ST₁突变基因；2、再用聚合酶链反应技术，设计并合成1对K88ac聚合酶链反应引物，上游引物P7为5｀-CATGCCATGGCATTTACTGACTATGAAGAA-3｀，下游引物P8为5｀-CCCAAGCTTGAGAATATCATTTCTTGATAG-3｀，其中P7、P8引物中分别含有NcoI、HindIII酶切位点，然后用P7和P8引物分别从大肠杆菌C83902质粒中扩增出K88ac抗原基因，扩增的产物用NcoI和HindIII双酶切，然后通过2％琼脂糖凝胶电泳分离、纯化双酶切的聚合酶链反应产物即K88ac抗原基因；3、再用聚合酶链反应技术，设计并合成1对LT_B聚合酶链反应引物，上游引物P9为5｀-CGCGGATCCCCAGACTATTACAGAACTA-3｀，下游引物P10为5｀-ATAAGAATGCGGCCGCAAGCTTGCCCCTCCAGCCTAGC-3｀，其中P9、P10引物中分别含有BamHI和NotI酶切位点，然后用P9和P10引物从大肠杆菌C83902质粒中扩增出LT_B抗原基因，扩增的产物用BamHI和NotI双酶切，然后通过2％琼脂糖凝胶电泳分离、纯化双酶切的聚合酶链反应产物即LT_B抗原基因；4、上述聚合酶链反应程序为：总体积为100μL，其中10μL 10倍反应缓冲液，10ng质粒DNA，200μmol/LdNTPs引物各250ng，3U Taq DNA聚合酶，按94℃ 60s→50℃ 60s→72℃ 90s的温度转换模式，共进行30个循环。5、通过T4 DNA连接酶连接反应，将3个ST₁突变基因串联在一起，再将K88ac抗原基因融合在3个ST₁突变基因的上游，然后将已构建的K88ac-ST₁-ST₁-ST₁融合基因融合在LT_B抗原基因的上游；最后，将构建的K88ac-ST₁-LT_B融合基因插入到表达载体pET-28b的NcoI和NotI的酶切位点上，构建了重组质粒pXKST3LT5，通过氯化钙转化法转入到受菌体BL21(DE3)中，构建成含K88ac-ST₁-LT_B融合基因表达载体的基因工程菌株BL21(DE3)(pXKST3LT5)；6、用碱性裂解法从构建的基因工程菌株中提取质粒，然后用内切酶酶切鉴定，用内切酶NcoI和HindIII可切下K88ac抗原基因；用内切酶HindIII和BamHI可切下3个串联在一起的ST₁突变基因；用内切酶BamHI和NotI可切下LT_B抗原基因；经DNA序列分析证实构建的K88ac-ST₁-LT_B融合基因序列正确，阅读框架正确。