[发明专利]表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内增殖的病毒及其构建方法

说明书

本发明涉及生命科学领域，具体涉及一种能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，及其构建和增殖的方法。

恶性肿瘤严重危及人类的生命健康。目前对恶性肿瘤的常规治疗仍为手术及放、化疗，这种常规治疗对极大多数肿瘤的疗效仍不十分理想，对于极大多数化疗药物而言，其治疗指数仍较低，即其治疗剂量与毒性剂量较为接近。故这种治疗方案通常伴有明显的毒性作用，包括危及生命的骨髓抑制等。因此，研究选择性杀灭肿瘤细胞而不影响正常细胞的方法对肿瘤治疗非常重要，这种选择性杀灭肿瘤细胞的方法主要依赖于肿瘤细胞的特异性标记，其疗效也决定于该肿瘤标记是否严格限制于肿瘤细胞内。

近几年来，关于肿瘤新生血管研究取得很大进展，Folkkman的研究小组提出了在肿瘤发生和发展过程中的“血管生成开关机制”，揭示了肿瘤微血管形成的分子机制。当肿瘤的半径＜2mm时，它主要依靠扩散在细胞周围的营养物质和氧气生存。随着瘤体的增大，肿瘤本身或宿主组织将建立起新生血管网以供给瘤体营养。肿瘤新生血管网的形成取决于肿瘤周围的微环境中诱导与抑制新生血管形成的因子相互作用结果，在肿瘤的发生及转移灶形成过程中，诱导及促进新生血管形成的因子如成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血小板来源的内皮生长因子(PDEGF)、白细胞介素-8(IL-8)、纤溶酶原激活因子(PA)及基质金属蛋白酶(MMP)等占主导地位，而抑制新生血管形成的因子如内皮抑素(endostatin)、血管生成抑制(angiostatin)、血管内皮细胞生长抑制因子(vascularendothelial cell growth inhibitor，简写为VEGI)、胶原蛋白XV的C-末端片段的内皮抑素等基因等处于劣势。从而导致肿瘤新生血管的形成，新生血管输送肿瘤细胞快速增殖所需的营养，也使肿瘤细胞的远距离转移得已实现。抑制肿瘤新生血管的形成，可阻断肿瘤细胞的营养供应，从而导致肿瘤细胞因营养不足而死亡，肿瘤明显萎缩乃至完全消褪。同时抑制肿瘤新生血管的形成，也达到阻断肿瘤转移的通路的目的。目前已有多种阻断肿瘤新生血管生成抑制因子进入临床试验。

肿瘤特异性增殖的病毒的根据肿瘤细胞与正常细胞某些生物学特性的差异，经过改造的病毒只能特异性地在肿瘤细胞内增殖、裂解肿瘤细胞，然后释放出病毒颗粒，再次感染其它肿瘤细胞，再次增殖、裂解，如此产生放大效应，由于病毒能够弥散到全身各个组织及脏器，因而能感染所有肿瘤细胞，从而杀灭局部及转移的肿瘤，而不影响正常细胞。

但迄今为止，尚未见到应用肿瘤特异性增殖的病毒系统高效表达血管生成抑制因子的报告。

本发明的目的在于提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒及其构建方法。

本发明的目的在于提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒的复合物。

本发明的目的在于研究上述能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒的应用。

本发明提供一类能高效表达血管生成抑制因子的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒，将编码血管生成抑制因子的核苷酸序列插入肿瘤细胞内特异性增殖的病毒基因组中的非增殖必需区域，该病毒选择性地在肿瘤细胞内增殖，而在正常细胞内基本不增殖，通过病毒在肿瘤细胞内复制增殖，导致编码血管生成抑制因子的核苷酸序列拷贝数增加，从而血管生成抑制因子基因表达量增加，该肿瘤细胞内特异性增殖的病毒可以是以下任何一种：(1)在肿瘤细胞内特异性增殖的野生型病毒；(2)病毒增殖必需基因的转录起始点与编码起始位点之间插入肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件；(3)蛋白功能缺失重组后能在肿瘤细胞内特异性增殖的病毒。

上述重组病毒可以是腺病毒、单纯疱疹病毒等，编码血管生成抑制因子的核苷酸序列可以是编码内皮抑素的核苷酸序列、编码血管生成抑素的核苷酸序列等。