[发明专利]编码dapC基因的核苷酸序列及生产L－赖氨酸的方法

说明书

本发明提供了编码dapC基因的核苷酸序列，和用具有增强的特别是过表达的dapC基因(N-琥珀酰氨基酮庚二酸转氨酶基因)的棒状细菌发酵生产L-赖氨酸的方法。

氨基酸特别是L-赖氨酸用于人用药物和制药工业，特别是动物营养。

已知氨基酸可通过棒状细菌菌株，尤其谷氨酸棒杆菌的发酵而生产。由于其极其重要性，已持续进行改良生产方法的尝试。生产方法的改良可涉及发酵措施，如搅拌和供氧，或营养培养基的组成如发酵期间的糖浓度，或产物形式的加工方法，例如通过离子交换层析，或微生物本身的固有生产性质。

为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变，选择及突变体选择等方法，以此方法可获得对抗代谢物如赖氨酸类似物S-(2-氨基乙基)半胱氨酸有抗性或重要的调节代谢物营养缺陷的并产生L-氨基酸如L-赖氨酸的菌株。

一段时间以来，重组DNA技术的方法也用于棒杆菌生产氨基酸的菌株的改良，其通过扩增各个氨基酸生物合成基因，并研究对氨基酸生产的作用而进行改良。此方面的综述文章见Kinoshita(＂谷氨酸细菌＂，工业微生物的生物学，Demain和Soloman编辑，BenjaminCummings，英国伦敦，1985,115-142),Hilliger(生物技术2,40-44(1991)),Eggeling(氨基酸6:261-272(1994)),Jetten和Sinskey(生物技术的关键回顾15,73-103(1995))和Sahm等(纽约科学协会年报782,25-39(1996))。

本发明人目的在于为改良L-赖氨酸的发酵生产而提供新措施。

L-赖氨酸用于人用药物及制药工业，特别是动物营养，因此提供生产L-赖氨酸的新改良方法总是令人感兴趣的。

当下文提到L-赖氨酸或赖氨酸时，不仅是指碱，也指盐，如赖氨酸单盐酸盐或赖氨酸硫酸盐。

本发明提供了一种来自棒状细菌的分离的多核苷酸，其含有选自如下一组的一种多核苷酸序列：

a)与编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，

b)编码包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，

c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及

d)包含a),b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。

本发明还提供了根据权利要求1的多核苷酸，其优选为能复制的DNA，包含

(ⅰ)选自SEQ ID NO:1的核苷酸序列，或

(ⅱ)在遗传密码简并范围内相应于(ⅰ)序列的至少一个序列，或

(ⅲ)与互补于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列杂交的至少一个序列，和任选地，

(ⅳ)(ⅰ)中中性功能有义突变。

本发明还提供了

权利要求4的多核苷酸，包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，

编码包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，

含有权利要求1的多核苷酸序列的载体，特别是穿梭载体或质粒载体pXT-dapCexp，其如图2所示并保藏在DSM 5715中，保藏号DSM 13254，

以及作为宿主细胞的含有载体的棒状细菌。

本发明还提供了基本上由一多核苷酸序列组成的多核苷酸，其可通过用含有相应于SEQ ID NO:1的多核苷酸或其片段的序列的探针杂交相应的基因文库，并分离所述的DNA序列来筛选获得，所述的文库包含具有相应于SEQ ID NO:1的多核苷酸序列的完整基因。

本发明的多核苷酸序列适用作RNA、cDNA和DNA的杂交探针，以分离编码N-琥珀酰氨基酮庚二酸转氨酶的全长cDNA，以及分离与N-琥珀酰氨基酮庚二酸转氨酶基因具有高度序列相似性的cDNA或基因。

本发明的多核苷酸序列还适用作通过聚合酶链反应(PCR)制备编码N-琥珀酰氨基酮庚二酸转氨酶的基因的DNA的引物。

作为探针或引物的这种寡核苷酸含有至少30个、优选至少20个、特别优选至少15个连续核苷酸。具有至少40或50个核苷酸的寡核苷酸也是合适的。

“分离的”是指从其天然环境中分离出来。

“多核苷酸”一般地涉及多聚核糖核苷酸和多聚脱氧核糖核苷酸，其可以是非修饰的RNA或DNA，或修饰的RNA或DNA。

“多肽”应理解为包括经肽键结合的两个或多个氨基酸的肽或蛋白质。