[发明专利]利用转基因真菌生产人胰岛素的方法

说明书

本发明是利用转基因真菌做为一种生物反应器来制造人胰岛素的方法。所选用的真菌受体包括食用和药用的高等担子菌如蘑菇、灵芝等。这些高等真菌无毒，可以直接服用，同时也可以从它们的菌丝中分离胰岛素成分制成注射用的人胰岛素。

本发明的主要创新之点在于：(1)人工合成胰岛素基因，选用适合于高等真菌和植物中表达的密码子来设计其DNA序列；(2)采用在真菌中高效表达的甘油醛磷酸脱氢酶基因的5端调控区的顺序来驱动人胰岛素的表达；(3)在受体真菌中引入来自透明颤菌(Vitreoscilla)的血红蛋白基因。该基因的表达，促进需氧代谢的进行。大大提高了人胰岛素生物合成的产量。

生物反应器是近年来许多生物技术研究部门十分关注的领域。诸如奶牛、奶山羊乳腺生物反应器生产人的生长因子。在植物生物反应器中利用马铃薯生产乙肝疫苗的研究受到广泛的重视。北京大学林忠平等人利用番茄生产多肽药物亦已取得良好结果。利用可以食用的蘑菇、香菇、灵芝一类高等真菌生产多肽成分具有很大的应用潜力。因为这些高等真菌能够完成对于多肽的折叠、糖基化修饰等功能，且有生长迅速、易于培养、不产生毒性物质的优点。

人胰岛素对于胰岛素依赖的糖尿病患者的治疗十分重要。

本项发明的技术要点如下：

(1)关于人胰岛的DNA序列

将人胰岛素的两个功能单位A链与B链的氨基酸顺序，采用真菌常用的或植物偏爱的密码子进行人工合成。A链与B链之间有一小的(含6个氨基酸)的连接片段。    (2)关于启动子的采用

采用在真菌中表达量很高的甘油醛磷酸脱氢酶(gluceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GPD)基因的5端调控区。本专利申请人克隆了该基因的上游区，并经实验证实1400bp的序列可以驱动报告基因(GUS或GFP)在真菌中高水平表达。

(3)关于透明颤菌血红蛋白基因的应用

近年来的研究表明来自透明颤菌(Vitreoscilla)的血红蛋白(hemoglobin)有很高的氧解离常数。将该基因导入细菌、真菌、酵母、高等动植物等各类生物后可以促进这些生物的需氧代谢。尤其在氧受限的条件下，此血红蛋白基因的作用更加明显。例如导入透明颤菌血红蛋白(VHb)基因的(Acremanun chrysogenum)显著增加了头孢霉素C的产量。VHb基因还使红色糖多孢菌增加红霉素产量70％。VHb基因在灵芝中明显提高了外源胰岛素基因的表达量。

(4)本项发明在引入人胰岛素基因的同时，采用真菌高效启动子驱动的VHb基因。在我们的一种实验中在外源基因表达载体上同时含有GPD启动子驱动下的人胰岛素基因和GPD启动子调控下的VHb基因。

其余的技术要点包括真菌菌丝体获得原生质体、对真菌原生质体的遗传转化、真菌转化中标记基因的选择、转化的真菌细胞的筛选，以及转基因真菌的鉴定。目的基因产物人胰岛素表达量的测定等。

关于本发明的实施方案：

在一个实施方案中关于人胰岛素基因的合成。在以植物偏爱密码子合成人胰岛素A链(63个碱基)和B链(90个碱基)DNA序列的基础上，依据真菌对密码子使用的偏爱性又做了适当的更动。将A链与B链组成的人胰岛素基因克隆于pGEM-11zf(+/-)载体上。见图一：人工合成的人胰岛素基因的克隆。

在一个实施方案中我们将人胰岛素基因置于甘油醛磷酸脱氢酶基因5’端调控之下。见图二：人工合成的人胰岛素基因表达载体的构建流程图(其中人胰岛素基因处于香菇组成型启动子PLeGPD的控制下)。

在一个实施方案中我们完成了香菇甘油醛磷酸脱氢酶LeGPD启动子驱动下透明颤菌血红蛋白基因(VHb)表达质粒的构建。见图三：透明颤菌血红蛋白(Vhb)基因表达载体的构建流程图(其中vhb处于香菇组成型启动子PLeGPD的控制下)。

在一个实施方案中我们按图四：含vhb的人胰岛素基因表达载体的构建流程图(其中vhb及人胰岛素基因均处于香菇组成型启动子PLeGPD的控制下)构建了同时含有磨菇甘油醛磷酸脱氢酶启动子(LeGPD)驱动的人胰岛素基因(Ins)和透明颤菌血红蛋白(VHb)基因的表达质粒。

在一个实施方案中我们采用下列程序进行真菌原生质体的制备和真菌遗传转化。其程序(药用蕈菌灵芝的遗传转化)如下：