[发明专利]桂竹香外源基因转移到桑树体内的制备方法

说明书

本发明涉及基因工程桑树植株外源基因的转移领域，更具体涉及一种桂竹香外源基因转移到桑树体内的制备方法。

桑叶是茧丝绸的物质基础。不断提高桑叶产量和质量，才能生产出优质的蚕茧、生丝和丝织产品，在竞争激烈的国际市场中立于不败之地。桑叶的蛋白含量是决定茧丝绸产品的质量的关键因素，普通桑树品种的蛋白含量还不能完全满足生产优质茧丝绸的需要，普通桑树抗虫性较差，桑叶产量较低，产量品质不高，饲养成绩不佳，经济效益低下。品种选育一直是提高桑叶产量、改良桑叶品质、带动生产进步的重要措施，但传统育种方法所需时间较长，过程繁琐，需耗费大量的人力和物力，而且通过杂交等方法获得的优良品种多容易受到亲本材料的限制。经检索未发现一种桂竹香外源基因转移到桑树体内的技术被公开。

本发明的目的是提供了一种桂竹香外源基因转移到桑树体内的制备方法，方法易行，操作简便。成功地解决了桑树工程植株将比常规品种在光合作用强度、桑叶蛋白质含量、营养物质的利用、转化和运输能力方面都大幅度提高的问题.并可增强桑树的抗虫性(但对家蚕无害)和抗逆性。

本发明是通过以下技术来实现的：

采用的桂竹香(Cheiranthus cheiri L.)是十字花科植物，其植株生长者大田中不易受蚜虫、鞘翅目昆虫为害，生长旺盛、光合作用极强。经研究发现，所克隆的细胞外膜蛋白基因(OEM1基因)在植物抗虫性、细胞物质运输、信号识别、传递、细胞代谢等方面起重要作用。植物的外膜蛋白，特别是叶绿体外膜蛋白是离子的传送器，传送Na⁺、k⁺这种传送器的基因在人、鼠、醇母中已得到，基因序列长约2.4kb，编码547个氨基酸，它与得到的OEM1基因有一定的同源性，因此OEM1基因与Na⁺、K⁺的传送有关。桂竹香外膜蛋白基因转移到桑树体内的步骤是：

1)构建双元载体系统：采用双元载体系统，通过反式激活T-DNA转移。双元载体系统主要包括两个Ti质粒，即mini-Ti和Helper Ti(Helper Ti质粒主要作用是提供vir基因功能，激活处于反式位置上的T-DNA转移)，其中mini-Ti质粒含有来自pTiT37的T-DND左右边界序列，在两个边界序列之间的T-DNA区含有植物选择标记和启动子的Nos-Npt-II，以及来自噬菌体M13mp19的多种酶连接接头的Lacz基因。在Lacz基因内部含有多克隆位点。外源基因(OEM1基因)可以便利地插入其间使其本身失活，并且可在含X-gal和IPTG的平板上直接筛选，操作极为方便。将OEM1基因用适当的限制性内切酶消化后与mini-Ti质粒相连，并在X-gal和IPTG的平板上筛选白色菌落，经提取质粒，酶切检查后，确定OEM1基因已插入了mini-Ti质粒的多克隆位点区，将mini-Ti质粒纯化后转化含有Helper Ti质粒的根癌农杆菌感受细胞，这时含有mini-Ti质粒和Helper Ti质粒的根癌农杆菌可直接用于植物细胞的转化。

2)构建受体系统：，选用桑树幼年期叶片作为受体，并在转化操作前，对幼叶进行抗生素敏感性测定，并根据野生型农杆菌在外植体组织中形成肿瘤的诱导率，发生时间及生长状态确定受体植物的敏感程度，从而选择浸染敏感的农杆菌种类。

3)目的基因(OEM1基因)的转化：首先采用光密度测定法来确定农杆菌浓度，为了保证菌种(普通)的纯化，采用多个单菌落分别培养成几个菌群进行保留或应用。挑取单菌落接种在液体培养基内进行液体振荡培养12-24小时，离心(4000r/min)，倒掉上清液，加入植物外植体诱导愈伤组织的液体培养基，使其OD₆₀₀值达到0.5。外植体在转化前预培养时间为2天。

预培养后的外植体切割成小块浸泡在菌液中，浸泡时间在5-8分钟内，用无激素植物培养基或无菌水漂洗，再用无菌吸水纸吸干，将其培养在诱导愈伤组织的固体培养基上，与农杆菌共培养，农杆菌转化时，并不“侵入”到植物细胞中，而是把T-DNA转移到植物细胞，在创伤部位生存16小时后菌株才诱发肿瘤，因此共培养时间长于10小时。但共培养时间太长，由于农杆菌的过度生长，植物细胞因受到毒害而死亡，因而采用GUS基因瞬时表达法测定共培养的最佳的时间，并根据获得的转化愈伤组织频率为最终依据，确定外植体共培养时间需4-6天。

4)外植体脱菌