[发明专利]基因多态性检测方法

说明书

本发明是涉及以引物延伸反应为基础，可用于一个或多个位点变异的基因多态性检测、基因顺序和基因表达高低的一种分析测定方法。

基因多态性分析检测，具有广泛的理论和实用价值，包括发育学研究，生物进化研究，疾病病因分析，药物研制和新药开发，农业育种等等。在医药卫生中意义尤为重大。有些遗传病直接与基因多态性，基因表达高低相关，某些疾病则与基因表达和环境因素相互作用有关。理论认为，类似的疾病可能具有类似的基因背景或类似的基因多态性。

基因多态性中，有单碱基多态性、基因插入、基因缺失或短重复序列数目的差异。以单碱基多态性最常见。生物品种数量繁多，各品种的特性由基因所决定。在化学本质上，基因由一系列不同排列的碱基序列构成，这些碱基为A,T或U,C,G。在同一物种的不同个体中，基因结构平均每一千个碱基就有一个碱基可能不同。单个碱基的不同，称单碱基多态性。其频率在不同基因又有不同，假基因中大约为0.11％，内含子中约为0.1％，外显子中则低于0.1％。

通过多学科的合作，已有多种方法可分析检测单碱基多态性。

目前分析检测单碱基多态性的方法均遵循下述原理之一。

一是利用单个碱基的不同引起的电泳速度不同。具体方法是毛细管电泳与光谱分析相结合。较可靠，但十分费时、昂贵，且只能一次分析一个位点的单碱基多态性。

二是利用单个碱基的不同引起的碱基配对互补性不同。有三种方法实现。单碱基延长反应法，进行两次不同的引物延伸反应；检测过程在没有放大效果的第二次引物延伸反应中进行，无法避免假阴性，特别是当待测基因的碱基位点与引物3′末端相同时，单碱基延伸反应可导致极高的假阳性，此法无实用价值。最为常见的聚合酶链式反应(引物延伸反应的一种)加上凝胶电泳法，先设计碱基多态性位点的引物时，利用聚合酶链式反应进行引物延伸；完全互补的引物能延伸而不互补的引物不能延伸，延伸的引物通过凝胶电泳辩认；既可靠又敏感，它是基于对单个位点的分析、不能进行单碱基多态性多位点分析。近期，一种高密度寡核苷酸生物芯片已用于单碱基多态性多位点分析，它先对待测样品进行双向引物延伸反应，将待测样品放大扩增，然后进行延伸产物与生物芯片间的杂交利用完全互补与部分互补的杂交所产生的信号强度差来识别碱基的变异；此法检测快速、可用于大规模工业化流水作业，但敏感性和可靠性差，有20％的假阳性、10％的假阴性，高误差限制了应用范围。

本发明的目的在于避免现有技术的不足之处，而提供一种高效、敏感、可靠，且适于大规模工业流水操作的基因多态性检测方法。

可采取以下的技术方案实现目的。基因多态性检测方法，以引物延伸反应为基础；包括以下步骤：a、制备待测目标基因的碱基特异性引物集合；b、进行引物集合的延伸反应；c、区分大量引物延伸产物与其他成分，其它成分包括未延伸的引物和用于引物延伸反应的dNTP混合物。用于基因多态性检测的物质包括DNA和RNA。通过酶反应延长目的基因特异性引物，再区分引物延伸反应产物与其他反应成分。

可用于一个或多个位点变异的基因多态性分析检测。用基因多态性碱基位点的特异性引物集合进行引物延伸反应，再利用单链特异性核酸酶的消化反应或基于分子量大小的简单机械分离对大量引物延伸产物进行快速分离，因此检测到的引物延伸产物可准确反映基因多态性的位点信息。

本技术方案相对现有技术具有如下优点和效果：

一、适用范围宽，可筛选单一标本中一个或多个基因多态性位点，筛选多个样品中一个或多个基因位点，以及测定基因多态性位点表达高低，还可通过对已知基因的顺序测定来寻找新的基因多态性位点。

二、以高度专一的多聚酶引物延伸反应为基本出发点对基因多态性测定方法改进，包括碱基特异性引物集合的设计，引物集合的3′末端标记，特异性引物集合与不同配对引物的联合使用，单方向与双方向引物延伸反应的选定，固相引物延伸反应和瀑布引物延伸反应的创造，大量引物延伸产物的快速高效分离等，从而使基因多态性测定的可靠性、高效性及适于大规模流水作业诸方面，达到较好统一；对整个基因的单位点基因多态性检测能在数小时内完成。

结合附图对本技术方案的内容作进一步详述。