[发明专利]提高微生物发酵方法中重组蛋白质产量的方法

说明书

在细菌中工业规模生产重组蛋白质是在发酵罐中进行的。同用摇瓶的实验室规模的实验相比，产量的提高可以通过增加单位体积中细胞量的方法来实现。补料分批技术可以达到很高的细胞密度。这是基于生长限制性的加入营养物质，一般是限制碳源/能源。(例如Riesenberg D.and Guthke，R.，1999，App.Microbiol.Biotechnol.51，422-430)。对于利用大肠杆菌的方法来说，通常是限制葡萄糖或甘油。或者，依所用的微生物和方法的不同，也可以限制其他底物，例如糖蜜，淀粉，蛋白胨，乳糖，甲醇和乙酸。高浓度的培养溶液可以连续加入，并有可能利用多种函数去详细描述一段时间内底物的加入情况，或是线性增加和减少。多种函数经常在同一种方法中互相结合使用。可以选择性的以脉冲方式或隔一定时间间隔加入营养性溶液，而养分的消耗或者养分量的降低低于作为下一次加样标志的某一给定浓度。(例如，Terasawa等，1990，EP0397097A1)。底物溶液的加入也可以通过其它参数来调节。溶解氧(DO-stat)，pH值(pH-stat)或者在线测得的排出废气中二氧化碳和氧气的浓度(例如Kerns等，Acta Biotechnol。8，285-289)都可以作为控制数据，以指导周期性地加入营养性溶液。这样作，底物浓度就在限制性和非限制的浓度之间变化。Chen等(1997，Biotechnol。 Bioeng。56，23-31)测量到，当高浓度的培养基周期性的加入补料分批培养物时，质粒的稳定性增加了。但在这些方法中，一个周期可以持续几分钟或者几小时，这些不利于产物的形成。

基因表达的标准载体是质粒，它们除了有复制起点之外，通常还含有编码目的蛋白质的DNA序列(产物基因)，以及用来保证质粒在培养繁殖时保持稳定性的选择性标志。产物基因的表达通常由调节序列控制，特别是由可调节的启动子控制。产物基因的表达由诸如化学诱导物(底物，底物类似物)，培养温度或其它培养条件(pH值，盐浓度，底物浓度)的改变等因素所激活。值得一提的是，也可以通过改变限制性底物，或者用乳糖诱导tac启动子以及将葡萄糖培养改为用乳糖培养等方式来实现诱导(Neubauer等，1992，Appl.Microbiol.Biotechnol.36，739-744)。那些能使宿主细胞对某种抗生素产生抗性的基因可作为选择性标记，以使质粒在宿主细胞中维持稳定。然后在生产重组蛋白质的培养物中加入相应的抗生素来杀死或抑制那些无质粒细胞的生长，因为这些无质粒细胞没有携带抗性基因。通常使用的抗性基因/抗生素组合有β-内酰胺酶/氨苄青霉素，氯霉素乙酰转移酶/氯霉素，四环素抗性(tet)操纵子/四环素，以及卡那霉素抗性基因/卡那霉素。

某些这类抗性体系有个缺点，那就是抗生素被抗性基因灭活，例如氨苄青霉素和氯霉素(例如Kemp G.W.and Britz M.L.，1987Biotechnol.Techniques 1，157-162)。这种灭活所造成的后果是使培养体系中无质粒细胞的繁殖失去了阻碍。另外，那些引起抗性的蛋白质在制备性培养物中会释放入培养基，从而加速抗生素的降解。在这些情况下，总培养体系中无质粒细胞的比例会升高。再者，由于成本的原因，或者由于后续清除过程所造成的附加费用(其中残留的微量抗生素或它的失活型必须除去)，在许多工业方法中，是不使用抗生素的。同时，在这些方法中，一定比例的无质粒细胞会出现。

尽管在生长期，无质粒细胞通常只占有一点点生长优势，但在许多情况下，当产物开始形成后，含有质粒的生产细胞(producing cell)的生长速率开始降低，从而导致培养体系中无质粒细胞群体的过度生长。无质粒细胞积累的缺点是会降低产物占总细胞量的相对比例；而且依所选用的分解和清除方法的不同，将造成这些发酵后步骤更加困难。

在构建载体时，是有可能限制这些不利影响的，例如通过挑选抗性基因，使用替代的不依赖抗生素的稳定性体系(Molin andGerdes，WO84/01172)，或者使用那些分解比较慢的改性抗生素；但是这些有问题的抗性仍在使用。再者，没有一个替代体系是无限稳定的；只能在某一时间跨度内维持稳定性。

在专利权力要求1中所述的发明是基于如下问题，即在补料分批发酵中，特别是在工业应用中，在诱导重组产物合成后，抑制无质粒细胞的过度生长，而不对产物形成产生不利影响。