[发明专利]氨基酸生产的代谢工程

说明书

                       发明背景

发明领域

本发明涉及微生物遗传学和重组DNA技术领域。更具体的说，本发明涉及氨基酸的发酵生产。本发明提供了可用于生产氨基酸的微生物、用于提高氨基酸产量的方法、和用于生产氨基酸的工艺。

相关技术

氨基酸的发酵生产能够由廉价的碳源(诸如糖蜜、乙酸、和乙醇)进行廉价的生产。在认识到棒杆菌属(Corynebacteria)可用于氨基酸的工业生产之后(S.Kinoshita等人，国际酶化学讨论会记录(Proceedings of the International Symposium of EnzymeChemistry)2：464-468，1957)，突变株的分离使得通过发酵工艺进行氨基酸商业生产变得更有可能。氨基酸生产的微生物工艺中采用的微生物可分成4类：野生型菌株、营养缺陷型突变体、调控突变体、和营养缺陷型调控突变体(K.Nakayama等人，在《食品和饲料蛋白质的营养改良》(Nutritional Improvement of Fodd and Feed Proteins)一书中，M.Friedman编，1978，第649-661页)。通过发酵生成的氨基酸的立体特异性使得该工艺比合成工艺更具优势；通过微生物工艺生成的氨基酸通常是L型的。

L-赖氨酸是通过工业发酵生产的氨基酸的一个范例。这种必需氨基酸的商业生产主要利用革兰氏阳性的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、和乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)进行(A.Kleemann等人，氨基酸(Amino Acids)，在《Ullmann氏工业化学百科全书》(Ullmann’s Encycolpedia of Industrial Chemistry)一书中，第A2卷，第57-97页，Weinham：VCH-Verlagsgesellschaft，1985)，这3种生物体累计每年生产大约250,000吨L-赖氨酸。

考虑到通过发酵工艺进行的L-赖氨酸生产在经济上的重要性，提高生产的总量同时降低生产成本将是有益的。为达此目的，在棒杆菌中深入研究了L-赖氨酸合成的生化途径(最近的评论见Sahm等人，纽约科学院年鉴(Ann.N.Y.Acad.Sci.)782：25-39，1996)。赖氨酸途径的入口开始于L-天冬氨酸(见图1)，而L-天冬氨酸是由草酰乙酸经转氨基作用生成的。谷氨酸棒杆菌的一个特殊特性是它能够通过两种不同路径将赖氨酸中间物哌啶-2，6-二羧酸转变成二氨基庚二酸，即通过涉及琥珀酸化中间物的反应或者通过二氨基庚二酸脱氢酶的单一反应。总之，进入该途径的碳流在两个点上受到调控：第一，L-苏氨酸和L-赖氨酸二者水平对天冬氨酸激酶的反馈抑制；第二，对二氢吡啶二羧酸合酶水平的控制。因此，可去调控和提高这两种酶的活性从而提高棒杆菌中的L-赖氨酸产量。

除了通向L-赖氨酸合成的生化途径，新的证据表明赖氨酸离开细胞进入培养基的转运是开发过度生成赖氨酸的谷氨酸棒杆菌菌株时需要考虑的另一个条件。Krmer及其同事的研究指出被动转运离开细胞，作为渗漏膜的结果，并不是赖氨酸外流的唯一解释；他们的数据提出具有下列特性的特异载体：(1)转运蛋白对赖氨酸具有较高的Km值(20mM)；(2)转运蛋白是OH^-同向转运系统(摄取系统是H⁺反向转运系统)；且(3)转运蛋白带正电荷，以及膜电位刺激分泌(S.Brer和R.Krmer，欧洲生化杂志(Eur.J.Biochem.)202：137-143，1991)。