[发明专利]生物活性材料的保存方法

说明书

本发明涉及生物活性材料例如病毒、细菌和生物分子的保存。具体地，本发明涉及一种超快方法，通过此方法可以采用脱乙酰壳多糖和二糖海藻糖保存这些材料。采用此方法可以实现对生物分子和微生物的长期保存，尤其是可以制备减毒活疫苗。

通过脱水和渗透压浓缩(osmoconcentration)保存生物可降解材料是一项普通的古老技术。当必需保存敏感生物分子时，通过脱水进行的简单干燥将无法胜任此任务，因为结构水的除去会引起随后的变性和生命活性的丧失。在液氮中低温贮藏和冻干已被接受为长期保存敏感生物分子的方法，后一种方法被广泛应用于保存减毒活疫苗。

通过延长第二个冻干周期以便使残留水分含量(RM)减少至大约1％-2％，已经使冻干牛瘟疫苗的耐热性获得了提高。按Mariner，J.C.等，Vet.Microbiol.，1990，21，195-209所描述的，这需要长达72小时的长时间和高能量消耗操作周期。由此方法制备的疫苗称作“THERMOVAX”，而与标准疫苗区分开。

正如以上提及的，目前使用的这些方法均耗时，并涉及高能量的投入。而且，冻干仅赋予终产品中等水平的耐热性，而且仍需要冷藏降低贮存过程中的变质。对于在热带气候下使用的活疫苗而言，这尤其是一个问题，因为这些疫苗会丧失效力而导致不幸的结果，即在难于监测“冷链(cold chain)”的热带国家中野外实施的接种计划将最终导致给患者接种低标准的或，在某些情况下，无效的疫苗。

在进化的自然选择过程中，某些植物和动物物种获得了出色而精巧的耐受极度脱水的能力，以致可以在有害环境中极长时间地保持休眠，并能在重新水化后仍具有完全的生命活性。实例包括更苏植物鳞叶卷柏(Selaginella lepidophyla)、海虾Artemia salina(Clegg，J.，J.Comp.Biochem.Physiol.，1967，20，801-809)、酵母类酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Coutinho，E.，生物技术杂志(Journalof Biotechnology)，1988，7，23-32)、和缓步动物Macrobiotushufelandi(Kinchin，I.M.，生物学家(Biologist)，1995，42，4)。这些生物被称为隐生的，而它们存活的方法被称作低温生活。所有表现出此能力的动物和植物物种都含有二糖海藻糖(α-D-吡喃葡糖基-α-D-吡喃葡糖苷)。海藻糖在大多数隐生生物中一般以约0.2g/g细胞干重的量存在，这使得这些生物可以抵抗极度脱水、高温、X-射线，以及在一些缓步动物物种中还可以抵抗高达600Mpa的压力。

Colaco等，生物技术(Biotechnology)1992，10，1007-1011，描述了采用海藻糖快速干燥生物材料的益处。该方法主要涉及在预先形成的固体基质例如纤维素纤维上，或在用于诊断目的例如ELISA或实验室中类似诊断应用的塑料板表面上，干燥限制性酶和免疫球蛋白。然而，当上升至工业应用时，例如大规模的商业疫苗生产，由于必需在部分密封的小瓶中采用必需的无菌技术操作大得多的单位数量和体积，这些技术产生多个问题。为了满足大规模疫苗生产的操作要求，即典型的1.0ml以上的单位体积和20升的生产批量，需要不同的策略以在经济上可接受的时间内除去该体积的水。在大气压力下，即使在最高的生理耐受温度下进行干燥也将需要一段无法接受的长时间以足够快地从部分塞住的疫苗小瓶中除去水分，而且将不可避免地导致变性和效力的丧失。

Nishimura.K等，疫苗(VACCINE)3，第5期(1985)显示，脱乙酰壳多糖团聚体对粘膜上皮具有高亲和性。这提示，这可能增强抗原向这些细胞中的主动运输，由此刺激IgA和IgG系统免疫应答。

本发明主要涉及在导致除去水分并同时允许维持生物活性材料的生物学完整性的条件下采用脱乙酰壳多糖和海藻糖保存生物活性材料的方法。

因此，本发明提供保存生物活性材料的方法，包括将该生物活性材料的水悬浮液与脱乙酰壳多糖或其无毒性盐的无菌水溶液相混合以形成该生物活性材料和脱乙酰壳多糖或其无毒性盐的团聚体(coacervate)；向该团聚体中加入海藻糖的无菌水溶液；在低于大气压的压力下，于初始不高于37℃并被控制在不降低至0℃或以下温度的温度下，将团聚体和海藻糖的无菌水混合物进行干燥，以形成包含亚稳定玻璃样海藻糖的玻璃样多孔基质，在该基质中含有脱乙酰壳多糖或其无毒性盐和干燥的生物活性材料。

根据一个优选实施方案，保存生物活性材料的方法包括步骤：