[发明专利]LIM矿化蛋白剪接变体

说明书

发明背景

1.发明领域

一般的说，本发明涉及哺乳动物的生骨细胞以及骨和骨组织形成。具体的说，本发明涉及在体外和在体内增强骨矿化效能的蛋白质新家族以及编码这些蛋白质的核酸。本发明提供了用于治疗与骨和骨组织有关的多种病理学状态的方法，诸如脊骨(spine)融合、骨折修复、和骨质疏松。

2.相关技术的描述

成骨细胞被认为是由多能间充质干细胞分化而来的。成骨细胞的成熟导致细胞外基质的分泌，从而矿化并形成骨。这种复杂过程的调控尚不太清楚，但是认为涉及一组已知为骨形态发生蛋白(bonemorphogenetic protein，BMP)的信号蛋白质。这些蛋白质已显示与胚胎背腹图式、肢芽发育、和成年动物的骨折修复有关(B.L.Hogan，基因和发育(Genes&Develop.)10：1580，1996)。这组转化生长因子β超家族分泌的蛋白质在多种细胞类型中在不同分化阶段具有不同活性；这些紧密相关分子的生理学活性差异尚未阐明(D.M.Kingsley，遗传学趋势(Trends Genet.)10：16，1994)。

为了更好的认识不同BMP信号蛋白的独特生理学作用，我们最近比较了BMP-6与BMP-2和BMP-4诱导大鼠颅盖成骨细胞分化的潜能(Boden等人，内分泌学(Endocrinology)137：3401，1996)。我们在需要BMP或糖皮质激素来发动分化的大鼠胎儿颅盖第一代传代(继代)培养物中研究了这种过程。在这种膜成骨形成模型中，糖皮质激素(GC)或BMP将发动趋向能够分泌骨钙蛋白(成骨细胞特异性蛋白质)的矿化骨结的分化。这种传代培养物系统不同于经历自发分化的大鼠成骨细胞原代培养物。在这种传代系统中，糖皮质激素导致10倍诱导BMP-6 mRNA和蛋白质的表达，它负责增强成骨细胞分化(Boden等人，内分泌学(Endocrinology)138：2920，1997)。

除了细胞外信号(诸如BMP)，细胞内信号或调控分子也可能在导致新骨形成的级联事件中发挥作用。一大类细胞内调控分子是LIM蛋白质，如此命名是因为它们具有称为LIM结构域的特征性结构基元。LIM结构域是由通过2-氨基酸间隔物连接在一起的两个特殊锌指组成的富含半胱氨酸结构基元。有些蛋白质只具有LIM结构域，而其它蛋白质具有多种其它功能性结构域。LIM蛋白质形成多样性组，包括转录因子和细胞骨架蛋白。LIM结构域的主要作用似乎是通过与相同或不同LIM结构域形成二聚体或者通过结合独特蛋白质来介导蛋白质-蛋白质相互作用。

在LIM同源结构域蛋白质(即具有两个LIM结构域和一种同源结构域序列的蛋白质)中，LIM结构域作为负调控元件发挥功能。LIM同源结构域蛋白质涉及细胞谱系决定的控制和分化的调控，尽管只含LIM的蛋白质可能具有相似作用。只含LIM的蛋白质还涉及细胞增殖的控制，因为编码这种蛋白质的几种基因与致癌染色体易位有关。

人和其它哺乳动物易患需要骨修复和/或再生过程的疾病或损伤。例如，能够刺激天然骨修复机制由此缩短治愈骨折所需时间的新治疗方案将改进骨折治疗。在另一个实例中，遭受全身性骨紊乱(诸如骨质疏松)的个体将受益于能够导致全身性新骨形成的治疗方案。这些治疗方案将降低由骨质流失引起骨折的发病率，而骨质流失是这种疾病的特征。

至少为了这些原因，已经研究了细胞外因子(诸如BMP)以用于在体内刺激新骨形成。尽管使用BMP和其它细胞外信号分子获得了早期成功，但是它们的应用也引起大量缺点。例如，增强新骨形成需要较大剂量的纯化BMP，由此增加了这种治疗方法的费用。而且，细胞外蛋白质在导入宿主动物后易于降解。另外，因为它们通常具有免疫原性，所以始终存在激发针对所用蛋白质的免疫应答的可能性。

出于这些考虑，需要使用细胞内信号分子诱导新骨形成的有用治疗方案。现在，基因疗法领域的进展有可能将构成骨形成过程一部分的细胞内信号的编码核苷酸片段导入生骨前体细胞(即涉及骨形成的细胞)或外周血白细胞。骨形成的基因疗法具有大量潜在优点：(1)生产成本较低；(2)由于能够长期表达细胞内信号，所以与细胞外治疗方案相比，效能较高；(3)回避细胞外信号疗法可能受到的信号受体数目有限的牵制；(4)能够将经转染的潜在骨原细胞直接投递至需要局部骨形成的位点；和(5)将能够进行全身性骨形成，由此为骨质疏松和其它代谢性骨疾病提供治疗方案。

                        发明概述