[发明专利]用转化的微藻生物合成外源蛋白质

说明书

1.发明领域

本发明涉及用转化的微藻生物合成外源蛋白质。更具体地说，本发明涉及通过用含有所需的外源蛋白质基因的DNA载体转化微藻原生质体，然后大规模培养以便生物合成外源蛋白质的方法。

2.现有技术描述

大肠杆菌是使用最广泛的异源表达系统，但是该细菌有一些限制：i)很难或不能表达某些特定的蛋白质，ii)一些重组蛋白质没有生物活性，iii)一些重组蛋白质对大肠杆菌是有毒的，以及iv)一些重组蛋白质形成不溶型包涵体。用酵母表达系统可能会发生类似的问题。已经用培养的哺乳动物和昆虫细胞解决这些问题，但这些系统由于培养基、装置以及需要进一步纯化过程而变得昂贵。

因此，本发明人对小球藻转化进行了研究，用其作为一种新的异源过量表达系统，它可以代替大肠杆菌以解决上述问题。

结果，我们发现由于微藻有比动物或植物更简单的代谢途径并可用含有光和二氧化碳的培养缸大规模培养，因此，微藻表达系统比细胞培养或动物或植物表达系统更经济。此外，微藻具有与大肠杆菌不同的翻译后修饰过程，这一事实表明在微藻中表达的外源蛋白质的生物活性应该与天然蛋白质的更类似。在这种情况下，我们计划开发微藻过量表达系统用于生产外源蛋白质。

已有人试图转化小球藻，微藻的一种。Jarvis和Brown描述了在Chlorella ellipsoidea的原生质体中瞬时表达萤光素酶(Jarvis，E.E.，andBrown.L.M.1991.Transient expression of firefly luciferase in protoplastsof the green alga Chlorella ellipsoidea，Current Genetics 19，317-321)，Dawson等发现通过用从Chlorella vulgaris分离出的硝酸盐还原酶基因转化Chlorella sorokiniana的硝酸盐还原酶缺陷型突变可以使所述突变体获救(Dawson，H.N.，Burlingame，R.，and Cannons，A.C.1997.Stabletransformation of Chlorella：Rescue of nitrate reductase-deficient mutantswith the nitrate reductase gene.Current Microbiology 35，356-362)。但是，这些试验仅描述了源自小球藻的蛋白质基因的瞬时表达或表达。

因此，本发明人对通过用含源自微藻以外之基因的载体DNA转化微藻的原生质体然后大规模培养从而生物合成外源蛋白质的方法进行了研究。结果，我们发现用所述方法可以达到上述目的。

本发明综述

本发明的目的是提供在微藻过量表达系统中稳定表达外源蛋白质的方法。

为了达到上述目的，本发明方法的特征在于所述方法包括下列步骤：(i)获得微藻的原生质体；(ii)制备含编码所需蛋白质之基因的载体，所述基因源自微藻以外的生物；(iii)将所述载体导入所述原生质体中以得到转化的原生质体，和(iv)培养转化的微藻以生产所需的蛋白质。

另外，本发明的方法除上述步骤之外，还可包括在步骤(iii)与(iv)之间用抗生素筛选转化细胞的步骤。

通过下列详细描述，本发明的上述和其他目的、特征和应用对于本领域技术人员来说将是显而易见的。

附图简述

图1表示在酶处理除去细胞壁前(a)和后(b)，通过荧光显微镜观察的用卡尔科弗卢尔荧光增白剂(calcofluor white)染色的Chlorellaellipsoidea细胞的照片。

图2表示用荧光显微镜观察的在转化的Chlorella ellipsoidea中的GFP表达的照片。

图3表示转化载体pCTV的示意图。

图4表示在含有或不含有腐草霉素的培养基中培养的转化的和未转化的Chlorella ellipsoidea的生长。

图5表示插入到转化的Chlorella ellipsoidea的基因组DNA中的鲆生长激素(下文称fGH)基因和Sh ble基因的PCR扩增和Southern印迹分析结果。