[发明专利]结肠直肠癌和其它胃肠病理学的非侵入性检测

说明书

此申请是1999年4月15日提交的、未决的美国申请09/292,358的部分继续。

                   发明背景

                   发明领域

本发明涉及分离的能够早期非侵入性检测结肠直肠癌和其它胃肠疾病的结肠细胞(colonocyte)。更为具体地，本发明涉及从少量粪便样品中获得的、生物学上基本纯的、起源于淋巴系统的分离活免疫粪便细胞(immunocoprocytes)与非上皮细胞。本发明还涉及提供用于在正常环境温度下从粪便样品中分离存活的结肠细胞的运送介质和分散或悬浮介质，以及使用本发明的分离结肠细胞进行结肠直肠与其它胃肠病理学检测的方法。所分离的结肠细胞还可用于其它异常的状况、症状、紊乱或病理状态的研究和测定。

                   现有技术

人类常见的一种胃肠道恶性肿瘤是结肠直肠癌。据估计，在美国结肠直肠癌占所有与癌症相关死亡男性和女性的14％，并且它的发病率仍就很高(Boring等人，加拿大临床癌症杂志(CA Cancer J.Clin.)1994；44：7-26)。如同其它恶性肿瘤的治疗一样，早期的检测对于这种癌症的成功治疗是至关重要的。

目前，检测结肠和结肠直肠肿瘤的筛选检查方法基于使用(a)粪便潜血检验(FOBT)，(b)可弯曲的乙状结肠镜检查，(c)双对照钡灌肠法，和(d)结肠镜检查。在这些筛选检验中，只有FOBT是非侵入性的、简便且相对便宜，它的依据是相对高可能性的结肠直肠癌出血。然而，FOBT频繁的假阳性与假阴性结果很大程度上限制了它的特异性和灵敏度。其它的操作都是昂贵的，并且是侵入性的。因此，确实需要提供一种简便、非侵入性的、可信赖的并且不昂贵的方法来检测结肠直肠癌、胃肠(GI)道疾病和其它病理状态。

结肠细胞是信息标志分子的一个重要来源，可提供受实验者胃肠道刚刚完成的代谢史景象。另外，这种细胞代表取自统计学大样本框的细胞群体，以非侵入性方式反映全长结肠上的结肠粘膜的状态，与使用涉及内窥镜检查的侵入性方法通过结肠活检的有限取样形成对照。

结肠细胞经历某种变化或转化，携带指示结肠病理学包括癌前和癌的状况的某种生物或化学标志。因此，结肠细胞可以作为胃肠道中肿瘤过程发作和其它病理生理变化的有价值的早期指标。基因和表面蛋白的微妙变化是这种肿瘤标记的实例。特别是Ki67、肿瘤表面糖蛋白CD4和肿瘤相关抗原19-9以及外源凝集素结合都是胃肠道中肿瘤转化的特异生物标志。因为快速分裂的细胞中含有较多的DNA，所以分离的结肠细胞中的DNA数量与肿瘤的存在也有着密切的相关性。众所周知，结肠腺瘤息肉和癌的形成是一个涉及癌基因(ki-ras)激活、肿瘤抑制基因(p53和APC)失活、以及DNA错配修复基因变更的多步骤过程。

迄今，在本发明所属的领域中通常认为，一旦结肠细胞脱落到粪便中，它们就会受到损害，其原因是它们一暴露到大气中细胞就开始破裂。粪便中的酶、粘液和细菌参与破坏结肠细胞的过程。例如，在美国专利#5,094,956、#5,380,647和#5,455,160中已经描述将新鲜收集的粪便样品冷冻到-20℃以下的温度，只是为保存化学成分，而没有考虑到细胞组分。因此，这些操作不保持细胞的完整性，不适于分离完整存活的、无其它杂质的细胞。

Dutta和Nair(肠胃病学(Gastroenterology)，114：1333-1335，1998)提及Albaugh等人(Int.J.Cancer，52：347-350，1992)和Iyengar等人(FASEB J.5：2856-2859，1991)曾成功分离到存活的结肠细胞。Albaugh等人基于Iyengar等人的早期工作描述了一种运送介质和方法从粪便样品中获得结肠细胞。但是，现有技术的运送介质与本发明的运送介质不同，Albaugh等人的介质差不多是由盐溶液组成的，其中除无脂肪酸的BSA之外，还添加了抗生素。换句话说，现有技术中的运送介质至少缺少一种标准，即不含有粘液分解剂，而依照本发明，对于运送介质的配制它是绝对必需的。