[发明专利]减数分裂活化甾醇增大着床率

说明书

发明领域

本发明涉及一种改善所获得的与体外受精和前成胚转移处理有关的卵母细胞和前成胚的生存力和怀孕潜力的新原理的用途。更明确地，本申请涉及通过提高在其中至少发生体外受精的培养基中的，并且也优选地在其中在体外受精之前培养卵母细胞的培养基中的，减数分裂活化甾醇的含量改善卵母细胞和前成胚的妊娠潜力。

发明背景

寻求不育治疗的夫妇，几乎没有例外地，将接受体外受精，其中发生卵母细胞和精子之间的体外会合。妇女通常正在接受用外生的激素治疗，从而调节和促进卵巢形成多于在自然月经周期期间见到的通常一个排卵前卵泡。本治疗的一部分包括从卵巢的排卵前卵泡中回收卵母细胞从而使卵母细胞成熟和/或体外受精。在体外受精和前成胚发育之后，将1到3个前成胚放置到妇女的子宫，她因此有怀孕和生育自己的孩子的可能。这现在是一项公认的治疗，它已经大规模进行了超过20年。

虽然实现怀孕的可能性这些年来已经增加了，但是回收的卵母细胞经历受精和前成胚发育的频率已经保持显著恒定，大约是60-70％。然而，被置换的前成胚仅有大约15-25％着床并发育成后代。因此，回收的卵母细胞仅有一部份产生孕体。虽然为什么体外发育的前成胚只有这样小的一部份拥有着床能力的原因在很大程度上还不知道，但是已经提出了数种解释(Salha等，1998)：卵泡/卵母细胞缺乏足够的成熟；卵泡/卵母细胞已经被暴露于最适度以下浓度的促性腺激素；卵母细胞的培养条件可能没有反映雌性生殖道内腔液的条件；卵母细胞遭受最适度以下的培养条件。

在其天然的环境下，在第一次位于输卵管期间在包围着卵母细胞的卵泡液的海洋中的卵母细胞被从卵泡中排出。卵泡液与来自输卵管的分泌物混合，确定了在其中发生受精的环境。卵泡液含有许多据信是增加卵母细胞细胞核和卵母细胞细胞质成熟的物质。最近的报告显示：特别是促卵泡激素(FSH)和表皮生长因子(EGF)参与了这些成熟过程。他们都存在于卵泡液，并且输卵管特别在排卵周围合成EGF(Morishige等，1993)。

哺乳动物卵母细胞在以存在核膜，和/或胚泡(GV)为特征的第一次减数分裂的前期内被停滞。当卵母细胞恢复减数分裂时，利用胚泡崩解(GVBD)，又称为卵母细胞成熟，使其被显示。在卵泡中，因为在卵泡液中存在的次黄嘌呤(HX)和其它嘌呤的抑制成熟的作用，卵母细胞停留在GV期。当在存在生理浓度的次黄嘌呤的条件下培养时，培养中卵母细胞也保持在GV期，如果HX被除去，则恢复减数分裂。HX对于在培养的小鼠丘包封的卵母细胞(cumulus enclosed oocytes)，以及失去丘的裸露卵母细胞中减数分裂恢复的抑制作用，可以通过加入减数分裂活化甾醇(meiosis activating sterols)克服，例如FF-MAS(4，4-二甲基-5α-胆甾-8，14，24-三烯-3β-醇)或T-MAS(4，4-二甲基-5α-胆甾-8，24-二烯-3β-醇)。从人的卵泡液分离和鉴定FF-MAS，并从牛睾丸分离和鉴定T-MAS(Byskov等，1995)。这些甾醇是胆固醇生物合成途径中的中间体，并且是羊毛甾醇的直接产物(Schroepfer等，1972)(图1)。

由CYP51基因编码的细胞色素P450羊毛甾醇14α-脱甲基酶(P45014DM)催化从羊毛甾醇合成FF-MAS。FF-MAS被甾醇14-还原酶(Δ14R)的活性转变为T-MAS。药物AY9944-A-7(AY)，选择性地抑制Δ14R的活性，它在二十世纪五十年代被用来降低血浆胆固醇。AY的化学结构与甾醇和胆固醇生物合成中的中间体完全无关(见综述：Mercer，1993)。几项研究已经显示，当在存在AY的条件下培养时，产生胆固醇的细胞，累积4，4-二甲基-5α-胆甾-8，14，24-三烯-3β-醇(也就是说，FF-MAS)。已经显示，AY(0.1μM)在培养的大鼠肝细胞中起一种Δ14R竞争性抑制剂的作用。

已经显示，在体外生理浓度的FSH在小鼠中促进卵母细胞成熟，还在人和猴卵母细胞的胚泡期内的卵母细胞中促进卵母细胞成熟(Schramm和Bavister 1995)。已经显示，FSH刺激丘细胞合成正促进成熟的物质(Byskov等，1997)。然而，最近的一项研究显示，FSH降低在存在FSH的条件下生长的一组前成胚的三倍性比率，提示FSH在减数分裂最后阶段的一个特异性作用(Merriman等，1998)。进一步地，通过将这些前成胚放置到假孕的小鼠中，已经显示，在卵母细胞成熟培养基中存在FSH的组中，较之于对照培养基，着床(implantation)的数量提高了，并且几乎相似于体内成熟的卵母细胞的着床数量。