[发明专利]草酰乙酸水解酶缺陷型真菌宿主细胞

说明书

                       发明背景

                       发明领域

本发明涉及编码具有草酰乙酸水解酶(oxaloacetate hydrolase)活性的多肽的分离的核酸序列。本发明也涉及突变的宿主细胞，特别是真菌突变宿主细胞如曲霉属的细胞，其草酰乙酸水解酶活性缺陷并因此导致其草酸生成缺陷。本发明也涉及突变细胞产生预期化合物如多肽、初级和次级代谢物的应用，以及在本发明的突变细胞中产生这类化合物的方法。本发明也涉及包含所述核酸序列的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生具有草酰乙酸水解酶活性的多肽的重组方法。

相关技术说明

丝状真菌广泛地用于各种目标化合物的商业生产，包括同源化合物，如初级或次级代谢物和通常由指定真菌产生的多肽，或异源化合物，如由已插入到指定真菌中的外源DNA编码的异源多肽。这类产品由所述真菌发酵产生并收获。

真菌物种黑曲霉广泛地用于所需化合物，例如柠檬酸和工业用酶的商业生产。众所周知，这种生物产生大量的草酸。出于多种原因，当该种生物用于感兴趣化合物的商业生产时，人们不希望有草酸的产生。例如，草酸的产生需要许多碳，这样，与只生产预期化合物的需求相比，必须额外地向发酵培养基中加入昂贵的碳源。发酵液中草酸的存在使涉及目的产物回收的下游操作产生了问题，因为草酸和钙形成了沉淀，从而干扰了回收：而且草酸是一种毒性化合物，这意味着它的存在被认为是由黑曲霉生产食品级产品的主要问题。

黑曲霉中草酸生物合成的两条途径已经被提出了。第一条路线是草酰乙酸+水→草酸+乙酸，该反应受草酰乙酸水解酶催化(Kubicek，C.P.，G.Schreferl-Kunar，W.Whrer和M.Rhr(1988)应用环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)54，633-637)。第二条路线包括乙醛酸(glycoxylate)途径(Balmforth，A.J.，A.Thomson(1984)：生物化学杂志(Biochem.J.)218，113-118)。

人们企图通过在低pH值下发酵来控制商业黑曲霉发酵过程中的草酸生成，在低pH值下几乎不形成草酸。但是，在低pH值下发酵可能是不受欢迎的，因为通常这一pH值对于黑曲霉的生长以及预期发酵产物的产量都不是最佳的。

来自于黑曲霉的部分纯化的草酰乙酸水解酶已经有记述(Lenz等，来自于黑曲霉的草酰乙酸的部分纯化和一些性质(Partial purification and someproperties of oxaloacetate from Aspergillus niger)1976，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)65：225-236)，但是编码该酶的基因尚未有描述。

本发明的目的是提供细胞如丝状真菌细胞，特别是黑曲霉细胞的突变体，其草酰乙酸水解酶的产生有缺陷，由此其草酸的产生也有缺陷。

                          发明概要

本发明涉及编码具有草酰乙酸水解酶活性的多肽的分离的核酸序列，它们选自：

(a)编码多肽的核酸序列，该多肽具有与SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少65％同一性的氨基酸序列；

(b)与SEQ ID NO：1的DNA序列的编码部分(由SEQ ID NO：1的1157-1411，1504-1411和1764-2383位的核苷酸组成)有至少65％同源性的核酸序列；

(c)核酸序列，其在中等严格的条件下，与(i)SEQ ID NO：1的核酸序列，(ii)SEQ ID NO：1的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的至少100个核苷酸的亚序列，或(iv)(i)，(ii)或(iii)的互补链杂交；

(d)(a)、(b)或(c)的等位基因变体；

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的亚序列，其中该亚序列编码具有草酰乙酸水解酶活性的多肽片段。

在一个更重要的方面，本发明涉及产生突变细胞的方法，其包括破坏或删除本发明的核酸序列或其调控序列，结果导致了产生比原细胞更少的草酰乙酸水解酶以及草酸的突变体。本发明也涉及通过该方法产生的突变体。

本发明也涉及包含所述核酸序列的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生所述多肽的重组方法。

               附图说明

图1显示了在实施例4中描述的质粒pHP3的构建。

           本发明的详细说明