[发明专利]草酰乙酸水解酶缺陷型真菌宿主细胞

权利要求书

1.编码具有草酰乙酸水解酶活性的多肽的分离的核酸序列，其选自：

(a)编码具有草酰乙酸水解酶活性的多肽的核酸序列，其氨基酸序列与SEQ ID NO：2的1至341位氨基酸至少有65％的同源性；

(b)核酸序列，其与由SEQ ID NO：1的1157-1411、1504-1651和1764-2383位核苷酸构成的核苷酸序列至少有65％的同源性；

(c)核酸序列，其在中等严格的条件下，与(i)SEQ ID NO：1的核酸序列，(ii)SEQ ID NO：1的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的至少100个核苷酸的亚序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链杂交；

(d)(a)、(b)或(c)的等位基因变体；

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的亚序列，其中该亚序列编码具有草酰乙酸水解酶活性的多肽片段；

2.权利要求1的核酸序列，其编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽。

3.权利要求1的核酸序列，其与SEQ ID NO：1的核酸序列至少有65％的同源性。

4.权利要求1的核酸序列，其含有SEQ ID NO：1的核酸序列。

5.权利要求1的核酸序列，其包含于质粒pHP 1中，后者又包含于大肠杆菌DSM12660中。

6.分离的核酸序列，其产生方法包括(a)在中等严格的条件下，使DNA与(i)SEQ ID NO：1的核酸序列，(ii)SEQ ID NO：1的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的至少100个核苷酸的亚序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链杂交；和(b)分离该核酸序列。

7.核酸构建体，其包括与一个或多个调控序列相连接的权利要求1至6中任一项的核酸序列，其中这些调控序列指导该多肽在适当表达宿主中的产生。

8.重组表达载体，其包括权利要求7的核酸构建体、启动子、和转录及翻译终止信号。

9.重组宿主细胞，其包含权利要求7的核酸构建体。

10.产生具有草酰乙酸水解酶活性的多肽的方法，其包括(a)在适于该多肽产生的条件下培养权利要求9的宿主细胞；和(b)回收该多肽。

11.产生突变细胞的方法，其包括使权利要求1至6中任一项的核酸序列或其调控序列被破坏或缺失，从而产生比该细胞更少的草酰乙酸水解酶的突变细胞。

12.权利要求11的方法，其包括：

(a)将包含产生草酰乙酸水解酶的至少一个基因的修饰的核酸序列导入亲代细胞，特别是亲代丝状真菌细胞中；和

(b)鉴定步骤(a)得到的突变细胞，其中在同样条件下培养时，该突变体产生比其亲代细胞更少的草酰乙酸水解酶。

13.通过权利要求11或12的方法产生的突变细胞。

14.根据权利要求13的突变体，其为丝状真菌细胞。

15.根据权利要求14的突变体，其为曲霉属如黑曲霉，支顶孢属，短柄霉属，隐球菌属，Filibasidium，镰孢属，赤霉属，腐质霉属，Magnaporthe，毛霉菌，毁丝霉属，漆斑菌属，Neocallimastix，链孢霉属，拟青霉属，青霉属，Piromyces，裂褶菌属，踝节菌属，热子囊菌属，草根霉属，Tolypocladium，或木霉属菌株的细胞。

16.根据权利要求11至15中任一项的突变体，其中在同样条件下培养时，该突变细胞产生比其亲代细胞至少少大约25％的草酰乙酸水解酶或草酸。

17.权利要求16的突变体，其中该突变细胞不产生草酰乙酸水解酶或草酸。

18.权利要求11至17中任一项的突变体，其中该突变细胞进一步包括一个或多个第三种核酸序列的一个或多个修饰，其中该修饰减少或消除了所述一个或多个第三种核酸序列的表达。