[发明专利]转移核酸通过核被膜的细胞转运系统的用途

说明书

本发明涉及一种核转运剂、一种含有所述核转运剂的基因转移系统、一种使用所述核转运剂将DNA转运到真核细胞核中的方法以及所述核转运剂在治疗癌症、病毒感染、神经系统疾病、移植排斥和单基因或多基因遗传疾病的基因疗法中的用途。

向核中的主动转运是将遗传材料转移到在打算表达遗传材料之前的时间内不分裂的所有细胞中必不可少的。由于核酸的核转运系统有利于有效地将DNA转移到很少分裂或根本不分裂的这些细胞中，因此核酸的核转运系统非常重要(Dowty等人，1995，Wilke等人，1996)。大多数初级细胞属于这一类。初级细胞在科学上最感兴趣有两个原因。首先，刚从生物体中分离的所述细胞反映的细胞类型的功能状态比由此获得的细胞系的好得多。其次，它们是基因疗法的靶细胞。此外，核转运系统通过使这些细胞也能表达转移的遗传材料增加了DNA向建立的细胞系转移的效率，它们在转移开始和分析之间的时间内尚未分裂。

遗传材料在细胞核中有活性。其中的转运或者可以在核被膜在有丝分裂过程中临时分裂时在细胞分裂期间同时进行或者它必须主动地进行。

1)通过核定位信号将核蛋白转运到该细胞核中。

包封该核的双层膜具有孔。小分子可以经扩散通过这些孔。为了能够进入核，大于约50kDa的蛋白质需要一核定位信号(NLS)，该信号必须通过转运机器识别。典型地，足够的信号由4-8个氨基酸组成，富含正氨基酸精氨酸和赖氨酸并含有脯氨酸。它在进化中强烈地保守，这样哺乳动物NLS也在酵母中起作用。异源NLS还可以用作将靶分子转运到核中的工具。为此，NLS可以相对随机的位置加入到胞质蛋白质的序列中，或者可以化学偶联到蛋白质或者甚至金颗粒上(参见Grlich，1998)。

2)许多病毒使用其细胞的核蛋白转运机将其DNA转运到其核中。

能够感染静息细胞的HIV和其它慢病毒使用病毒蛋白和细胞转运机器将其DNA转运到其核中。Vpr中的NLS和HIV预整合复合物中的基质蛋白(Gallay等人，1996)是感染不分裂的细胞所必需的(Naldini等人，1996)。尽管几乎不知道病毒是如何将其基因组转移到其核中的，但是含有NLS的病毒结构蛋白的帮助甚至可能是一般原理。通过以下观察也暗示了这一点：在HSV衣壳蛋白中的特异性突变防止了病毒DNA向其核中的转运(Batterson等人，1983)。腺病毒DNA与分裂衣壳的六邻体蛋白一起转运到核中(Greber等人，1993)。SV40 DNA向核中的转运由保持与DNA结合的病毒蛋白(可能是Vp3)介导(Nakanishi等人，1996)。含有NLS的两种细菌蛋白负责根癌土壤杆菌T-DNA向植物细胞核的输入(Citovsky等人，1994)。

由于一些病毒能够感染静息细胞，因此将例如HIV、腺病毒和疱疹病毒的突变体变体用作开发基因疗法方案的DNA转移载体。首先，这涉及与病毒组分的免疫反应的危险(Friedmann 1994，1996)，其次，将辅助细胞系用于这些系统，为此不能排除突变较少的病毒基因组的释放。而且，这些系统难以操纵。

已描述了通过含有核定位信号的肽或蛋白质推断提高转染效率的几个人工系统。

A)蛋白质

Kaneda等人(1989)以及Dzau和Kaneda(1997，US5,631,237)描述了一种基因转移系统，它是以使用仙台病毒、脂质体和意思是支持DNA的核转运的加入的蛋白为基础。为此，该组使用HMG-1(″高迁移率组1蛋白″)，一种与DNA结合的碱性非组蛋白的染色质蛋白质。HMG-1通过一长碱性区与DNA结合。它位于核内，但没有已知的NLS。在体外，HMG-1蛋白质与载体DNA形成复合物。纯化HMG-1的生产费用高且为劳动密集型。

Mistry等人(1997)描述了与HMG-1-介导的核转运有关的实验。由于作为复合DNA的转染试剂的其正电荷HMG-1在这里用于使DNA通过细胞膜。Wako BioProducts公司(Richmond，VA，USA)作为介导核转运的脂转染试剂的添加剂销售(1997)蛋白质HMG-1和-2。

Fritz等人(1996)用小牛胸腺组蛋白或由SV40 NLS和人组蛋白H1组成的重组蛋白进行了一相似试验。这两种蛋白都明显地与DNA形成大的复合物，正如出版物中所示，它们适宜通过细胞膜，但不适宜核转运。

B)由于含有NLS序列的合成肽生产简单且费用较低，因此也使用它们。