[发明专利]在宿主生物体中可控性收获后生产蛋白质的方法

说明书

本发明涉及一种从转基因宿主生物体内获得所需要蛋白质的方法，编码这一蛋白质的基因仅在宿主生物体收获后才表达，所述方法的特征在于所述基因只有在宿主生物体收获后经由周围相、尤其是气相或液相向宿主生物体提供的化学诱导剂存在时才表达。

天然存在的蛋白质的量通常非常少，不过其用作活性物质和材料的特征是非常令人感兴趣的。蛋白质通常还可以从重组的宿主生物体中获得，例如细菌，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等，但是考虑到经济条件和足够的量，这种生产方式效率不高，所以不能进行商业应用。要想在低等生物中表达不易生产或根本就不能生产的更复杂的蛋白质，需要更多的具有固有的复杂蛋白生物合成机制的高等生物细胞作为宿主细胞进行蛋白质的生产。在这种情况下，转基因动物、植物、真菌、苔藓、藻类等作为新的重组宿主至今已有好多年了。随着分子生物学研究提供越来越多的特征得以阐明的蛋白质，这一技术的应用日益显得重要。

但是，外源蛋白的表达对宿主生物体的正常生理状态可能具有不利影响，例如影响或甚至抑制宿主的生长。另外，例如，如果栽培表达具有医用活性蛋白的转基因植物，据信当植物生长时，外源蛋白质对环境中的生物体可能具有潜在危害。因此，在转基因宿主生物体、特别是通过农业或园艺方法栽培的转基因宿主生物体中收获后生产外源蛋白质作为技术学模块进行经济、环境相容的蛋白质提取是非常重要的。通过表达参与生物合成途径的酶，还可以在转基因宿主生物体中制备其他(生物)化学物质。但是，这也可能会给宿主生物体带来不利影响，如抑制生长或宿主生物体安全性问题。由于在宿主生物体内生产(生物)化学物质也基于蛋白质、尤其是酶的表达，所以可以使用相同的技术标准。

迄今所报道的收获后生产系统仅仅是基于植物材料的创伤，例如在烟草植物情况下是通过切割烟草叶子而产生创伤。其结果是，田间种植时的烟草不产生所需要的蛋白质，只有在回收步骤之前在收获后才产生蛋白质。但做到这一点非常困难，因为在农业或园艺培植时，一些情况可以造成植物的损伤，如施肥、大风或冰雹、碰撞、农具等，这些损伤可以诱导转基因植物(如烟草)的损伤诱导的启动子。以前的方法的另一个缺点是还很难做到诱导刺激物在全部植物物质上的单态分布。

所以本发明是基于提供所需要蛋白的收获后生产系统的技术问题作出的，本发明克服了现有技术中描述的方法的缺点，即保证了基因仅在收获后可靠表达，因此不必切割植物组织，并且诱导剂可以有效、均一地与相应的转基因宿主生物体细胞接触。

根据本发明权利要求书中所述的方法，可以解决这一技术问题。

本发明的方法中，通过经宿主生物体的周围相给予的化学诱导剂，诱导宿主生物体中外源基因的表达。宿主生物体的周围相可以为气相或液相，其中在气相中，通过改变气相的组成可以进行化学诱导，优选厌氧诱导；通过雾化固体或液体(生物)化学诱导剂的溶液(悬浮液)或者使用挥发性物质，使诱导剂分子在反应容器中呈均态分布。再者，也可以使用固体或液体(生物)化学诱导剂的溶液，在液相中进行化学诱导。使用本发明的方法可以大规模地生产制备高质量的蛋白质或其它(生物)化学物质，因此该发明可用于新型的生物医药和工程领域。

因此，本发明包括一种从转基因宿主生物体中获得所需蛋白的方法，编码这一蛋白质的基因只在宿主生物体收获后表达，该方法特征在于：

(a)转基因宿主生物体含有编码所需蛋白质的基因，该基因只有化学诱导剂存在时才表达；以及

(b)与化学诱导剂的接触在宿主生物体收获后通过宿主生物体周围的相，尤其是气相或液相而发生。

构建本发明方法所使用的核酸构建体的方法为本领域中熟练的技术人员所熟悉，这些方法还可以参见经典专著(参见Sambrook等，1989，分子克隆实验指南，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)。核酸构建体优选地插入在载体中，载体优选质粒、粘粒、病毒、噬菌体或其他遗传工程中常见的载体。这些载体还有其它的功能单位以保证这些载体可以在宿主生物体内稳定存在，如细菌复制起始位点或用于在啤酒酵母中稳定的双微小DNA。也可含有土壤杆菌T-DNA的“左边界”和“右边界”序列，以保证目的基因可以稳定地整合到植物基因组中。另外还可含有终止序列，保证转录正确终止和转录本的多聚腺苷酸化(Poly-A)。文献中有对这些元件的描述(参见：Gielen等，EMBOJ，1989，23-29)，还可以根据需要进行互换。