[发明专利]控制OmpT蛋白酶切割的方法

说明书

发明领域

本发明涉及通过应用调查大肠杆菌OmpT蛋白酶的底物特异性已发现的新切割和识别位点控制OmpT蛋白酶对多肽的切割的方法。

一方面，本发明涉及利用OmpT蛋白酶切割多肽的方法。更具体地说，它涉及利用OmpT蛋白酶的新切割和识别位点切割多肽的方法。

另一方面，本发明涉及利用OmpT蛋白酶从融合蛋白质中切出生理活性肽、蛋白质及其衍生物的方法。更具体地说，它涉及这样一种方法，即通过调查OmpT蛋白酶的底物特异性，从而发现新切割方法及切割和识别位点，然后利用此特性从融合蛋白质中有效生产生理活性肽、蛋白质及其衍生物。

本发明进一步涉及避免在非预期位点由OmpT蛋白酶对多肽进行切割的方法。尤其是，它涉及避免在宿主细胞产生的状态下由OmpT蛋白酶切割生理活性肽、蛋白质和其衍生物的方法。也就是说，本发明提供了通过改变OmpT蛋白酶切割位点或其附近的氨基酸序列而制备不(或几乎不)可被OmpT蛋白酶切割的生理活性肽、蛋白质或其衍生物的方法。

现有技术

大肠杆菌OmpT蛋白酶是存在于大肠杆菌外膜部分的蛋白酶并主要选择性的切割碱性氨基酸对之间的键(Sugimura,K.和Nishihara,T.细菌学杂志(J.Bacteriol.170:5625-5632,1988)。此酶分子量为36000，似乎归类于丝氨酸蛋白酶类。Sugimura等人调查了该OmpT蛋白酶的底物特异性，并报道了此酶特异切割碱性氨基酸对精氨酸-精氨酸、赖氨酸-赖氨酸、精氨酸-赖氨酸和赖氨酸-精氨酸中心的肽键。此外，已发现了氨基酸序列中除上述碱基对之外的其它切割位点。即，已报道通过OmpT蛋白酶的切割出现于精氨酸-甲硫氨酸(Zhao,G-P.和Somerville,R.L.生物化学杂志268,14912-14920,1993)、精氨酸-丙氨酸(Lassen S.F.等，Biochem.Int.27:601-611,1992)和精氨酸-缬氨酸(Maurer,J.细菌学杂志179:794-804,1997)。此蛋白酶的特征在于它并非切割含这些序列的所有蛋白质和多肽，而是专门在特异位点切割特异蛋白质和肽。例如，γ-干扰素包含如上所述的10个序列，但其中只有两个序列可被OmpT蛋白酶专门切割(Sugimura,K.和Higashi,N.细菌学杂志170:3650-3654,1988)。T7RNA聚合酶含如上所述的17个序列，但其中只有两个序列可专门被OmpT蛋白酶切割(Grodberg,J和Dunn,J.J.细菌学杂志170:1245-1253,1988)。这些事实表明关于OmpT蛋白酶切割位点的上述资料不可应用于其切割位点的估计，它不同于通常应用在蛋白质肽谱中的AP-1和胰蛋白酶，后二者的切割位点可以已知数据为基础进行估计。既然OmpT蛋白酶的切割产生于蛋白质或肽的特异位点，预期除上述氨基酸序列外的其它氨基酸序列(即切割位点的N-末端和C-末端氨基酸序列)可能参与切割。不过，至今仍未知什么氨基酸序列允许(或不允许)切割。

然而，因为它对切割位点具有高特异性且是大肠杆菌内源蛋白酶之一，OmpT蛋白酶已被用于从基因重组技术构建的融合蛋白质中切下靶多肽。为了利用大肠杆菌释放和产生胆固醇酯酶，Hanke等人成功地将酯酶与大肠杆菌溶血素A蛋白质融合且融合蛋白质被释放于细胞外，然后通过外膜上的OmpT蛋白酶处理蛋白质从而成功地从融合蛋白质中获得活性胆固醇酯酶。Hanke等人应用具有精氨酸-赖氨酸序列的接头并用OmpT蛋白酶切割此序列(Hanke,C等人，Mol.Gen.Genet.233:42-48,1992)。

本发明的发明者发现OmpT蛋白酶抗变性剂，他们阐明利用上述特性可在变性剂存在下切割作为包涵体表达的融合蛋白质。即，通过在大肠杆菌表达系统中以包涵融合体形式表达S.aureus V8蛋白酶衍生物融合蛋白质，用尿素将其溶解，然后在尿素存在下利用OmpT蛋白酶从融合蛋白质中释放V8蛋白酶衍生物部分并最后再折叠，本发明的发明者成功地生产了具有酶促活性的V8蛋白酶衍生物(Yabuta,M.,Ochi,N和Ohsuye,K.应用微生物工程技术44:118-125,1995)。