[发明专利]一种生产克隆牛的方法

说明书

本发明的背景技术

发明领域

本发明涉及一种生产克隆牛的方法，更具体地说，涉及一种生产由体细胞衍生的克隆牛的方法，此方法利用体外成熟、然后使卵母细胞去核、核转移、电融合和激活胚胎、后激活并在体外培养胚胎，然后把胚胎移入代孕母牛中。本发明还涉及由上述方法生产的胚胎和克隆牛。

发明背景

人们长期考虑用受精生产动物，这涉及到雌雄配子。然而人们已经进行了巨大的努力生产具有相同的外貌和相同的遗传特征的克隆动物。

30年来，已知只可能在两栖动物中克隆受精卵，但目前已成功地在小鼠中通过置换单细胞受精卵的前核生产出克隆的子代(见：McGrath和Solter，科学，220:1300-1302,1983)。虽然在克隆动物上有了这个首例成功，畜牧业上的同样成功(见：Wakayama等，自然，394:369-374,1998)却报告得相当晚，因为用2-细胞期后的成熟卵母细胞和受精卵裂球生产克隆小鼠有几个问题，例如重编程序的减少等。

有关通过核转移生产克隆牲畜，首例报告是通过用8-到16-细胞受精卵的裂球作供体细胞生产绵羊的子代(见：Wiladsen，自然，320:63-65,1986)。此后，据认为通过核转移只能克隆具有全能性的受精卵，籍此细胞可分化成每一个单细胞。然而，经过持续的研究工作，首例克隆绵羊是通过导入体细胞核生产的(见：wilmut等，自然，385:810-813,1997)，从而纠正了在先的发育理论，并使得在生产克隆牛(见：Welk，等，Reprod.Fertil.And Develop.,10:369-378,1998)和猪方面出现了成功例的报告。

但是现有技术的方法被证实通过核转移生产胚胎的产出量低下，在这个意义上是不太令人满意的，其结果是克隆动物的生产率低下。

在此情况下，有强烈的理由探索和开发一种改进的方法，按照通过核转移生产胚胎的思想生产体细胞衍生的胚胎。

发明概述

根据本发明，我们发现：通过缩短卵母细胞操作时间，和在供体细胞移入去核卵母细胞时加快核转移及激活的速率可以急剧地增加通过核转移生产的胚胎的产量，以此可以用有效的方式生产体细胞衍生的克隆牛。

因此本发明的首要目的是提供一种通过体细胞的核转移生产克隆牛的方法。

本发明的另一个目的是提供通过所述方法生产的克隆牛胚胎。

本发明的又一个目的是提供通过所述方法生产的体细胞衍生的克隆牛。

附图的简要说明

由以下描述结合附图会清楚了解本发明的上述目的和其它目的及本发明的特征，图中：

图1为供体体细胞的照片。

图2是一张照片，表示用一根持定(细玻璃)管和一根切割(细玻璃)管切割受体卵母细胞由透明带的过程。

图3是一张照片，表示通过从受体卵母细胞取走第一极体和胞核进行去核的过程。

图4是一张照片，表示用一根持定管和一根注射管把体细胞移入去核的卵母细胞的过程。

本发明的详细描述

本发明生产克隆牛的方法包含以下步骤：制备从牛身上采集的供体体细胞系；在体外将从卵巢采集到的卵母细胞培育成熟；去掉卵母细胞周围的丘(cumulus)细胞，切割成熟的卵母细胞透明带的一部分并且挤出部分包括第一极体的胞质，以得到去核受体卵母细胞；通过把供体细胞注射进去核卵母细胞把核移入受体的卵母细胞，然后通过随后的电融合和激活电融合后的细胞得到胚胎；后激活并且在体外培养胚胎；然后把培养的胚胎移入代孕母牛以生产克隆牛犊。

本发明的生产克隆牛的方法进一步说明如下。步骤1：制备供体细胞

把从牛身上采集的体细胞系制备成供体细胞。尽管没有限制供体细胞的牛的品种，但优选用韩国牡牛(Bos taurus coreane)和荷兰牛(Bostaurus)制备供体细胞。从牛身上采集的细胞系包括从子宫冲洗液、子宫内膜、输卵管、耳或者肌肉、丘细胞或者胎儿成纤维细胞采集的细胞，可使用常规的公知方法稍加改动后，制备这些细胞系(Mather&Barnes，细胞生物学方法，第57卷，动物细胞培养方法，Academic Press,1998)。