[发明专利]一种生产克隆牛的方法

权利要求书

1．一种生产克隆牛的方法，该方法包括以下步骤：

(Ⅰ)制备从牛身上采集的供体体细胞系；

(Ⅱ)在体外将从卵巢采集的卵母细胞培育成熟；

(Ⅲ)去掉卵母细胞周围的丘细胞，切割成熟的卵母细胞透明带的一部分以产生裂口并且通过该裂口挤出部分包括第一极体的胞质，以得到去核受体卵母细胞；

(Ⅳ)通过把供体细胞注射进去核受体卵母细胞而将一个核移入受体的卵母细胞，并通过随后的电融合和激活电融合后的细胞得到胚胎；

(Ⅴ)后激活并且在体外培养胚胎；

(Ⅵ)然后把培养的胚胎移入代孕母牛以生产克隆牛犊。

2．根据权利要求1的生产克隆牛的方法，其中所述制备体细胞系的步骤(Ⅰ)包括从子宫冲洗液、子宫内膜、输卵管、耳或者肌肉、丘细胞或者胎儿成纤维细胞采集的细胞。

3．根据权利要求1的生产克隆牛的方法，其中所述体细胞系通过传代培养、血清饥饿培养或者冷冻来保存。

4．根据权利要求1的生产克隆牛的方法，其中所述步骤(Ⅲ)中，在透明质酸酶处理后用剥脱管物理去掉卵母细胞周围的丘细胞。

5．根据权利要求1的生产克隆牛的方法，其中所述步骤(Ⅲ)中，卵母细胞去核是通过：用微操作器切割卵母细胞以在卵母细胞上造成一个裂口；将卵母细胞以其裂口竖直取向并且用一根持定管持定卵母细胞的下部以防止它移动；用一根切割管经此裂口把包括第一极体的10％到15％胞质从卵母细胞中挤出。

6．根据权利要求1的生产克隆牛的方法，其中所述步骤(Ⅳ)中的胞核转移是通过经在卵母细胞的透明带上造成的裂口，将供体细胞注射进入去核的受体卵母细胞进行的。

7．根据权利要求1的生产克隆牛的方法，其中所述步骤(Ⅳ)中电融合是通过间隔1秒每次15微秒施加的0.75到2.00千伏/厘米的两次直流脉冲进行的。

8．根据权利要求1的生产克隆牛的方法，其中所述步骤(Ⅳ)中，如果电融合在含钙离子的介质中进行，激活步骤和电融合同时发生。

9．根据权利要求1的生产克隆牛的方法，其中所述步骤(Ⅳ)中，如果电融合在不含钙离子的介质中进行，激活步骤在离子霉素溶液中在黑暗中进行。

10．根据权利要求1的生产克隆牛的方法，其中所述步骤(Ⅴ)中的后激活通过在放线菌酮溶液或者DAMP(4-二甲氨基嘌呤)溶液中培养胚胎而进行。

11．根据权利要求1的生产克隆牛的方法，其中所述步骤(Ⅴ)中的体外培养是通过在mTALP、mSOF或者mCR2aa介质中培养后激活的胚胎进行的。

12．根据权利要求1的生产克隆牛的方法，其进一步包括储存在步骤(Ｖ)中经体外培养的胚胎以备后用的步骤，此步骤是在含有青霉素-链霉素、CaCl₂、葡萄糖、MgCl₂、丙酮酸钠和磷酸盐缓冲的盐水的冷冻介质中冷冻后进行的。

13．一种胚胎，韩国牡牛胚胎/TcEar(KCTC 0719BP)，它是通过权利要求1的步骤(Ⅰ)到(Ⅴ)，分别用韩国牡牛的耳细胞和卵母细胞作为胞核供体和受体卵母细胞生产的。

14．一种胚胎，SNU2(牛NT胚胎，KCTC 07531BP)，它是通过权利要求1的步骤(Ⅰ)到(Ⅴ)，分别用荷兰牛的耳细胞和卵母细胞作为胞核供体和受体卵母细胞生产的。

15．一种克隆牛，它是通过用权利要求13所述的韩国牡牛胚胎/TcEar(KCTC 0719BP)作为胚胎，经权利要求1的步骤(Ⅵ)生产的。

16．一种克隆牛，它是通过用权利要求14所述的SNU2(牛NT胚胎，KCTC 07531BP)作为胚胎，经权利要求1的步骤(Ⅵ)生产的。