[发明专利]一种能够提高结构基因表达的内含子及其应用

说明书

本发明涉及一种一种能够提高结构基因表达的内含子；以及利用该内含子提高目的基因表达活性的方法；和利用该内含子提高植物抗虫活性的方法。

据不完全统计，全世界每年因病虫害造成的损失约占农作物总产量的37％，其中13％是由虫害引起的(Gathehouse A.M.R.1992)。目前，对农作物害虫的防治主要依赖化学药物。化学杀虫剂在农业生产中的确起到了重要作用，但同时也带来了许多严重问题：一方面，不仅提高了生产成本同时还造成了严重的环境污染和食品中可怕的残毒。另一方面，化学杀虫剂的作用方式是非特异性的，在杀害虫的同时，也会毒害到有益的昆虫及害虫的天敌。从而危及到多种生物资源，破坏生态平衡。长此以往，将会使人类遭受难以估计的损失。为了解决这些问题，必须提高植物自身对害虫的抗性。

近几年来，基因工程技术的发展为培育抗虫作物提供了有力手段。利用基因工程技术把外源抗性基因转化至农作物中并使其表达，从而使农作物获得抗性。目前，已有多种途径可获得抗虫植物。目前，在抗虫基因工程中利用的抗虫基因主要包括苏云金杆菌的δ-内毒素基因和植物来源的抗虫基因(如蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、凝集素基因等)。天然的苏云金杆菌δ-内毒素基因在植物中表达水平低，必须经过人工修饰后才能在抗虫基因工程中发挥作用(Jouanin L.1998；Estruch J.J.1997；Perlak F.J.1991)。并且这种抗虫转基因食物难以被人们接受，所以这种基因不适于转化粮食作物。植物来源的蛋白酶抑制剂是一类含量较为丰富的蛋白质，分子量小，性质稳定，抗虫谱广，故在抗虫工作中有重要作用。蛋白酶抑制剂杀虫机理在于：它能与昆虫消化道的特异蛋白消化酶相互作用，形成酶—抑制剂复合物，阻断或减弱消化酶的蛋白水解作用。一旦昆虫摄食蛋白酶抑制剂就会影响对外来蛋白的消化，最终造成昆虫的非正常发育或死亡(Jouanin L.1998)。在正常情况下，人类和动物所摄取的食物本身就含有蛋白酶抑制剂，并且植物蛋白酶抑制剂经过煮熟后就会失活，因此从食品安全性上考虑，利用植物蛋白酶抑制剂进行抗虫研究是一种最为安全的策略(Duan X.L.1995)。

尽管植物蛋白酶抑制剂有许多优点，但是和δ-内毒素相比，其杀虫活性较低。如在体外杀虫活性分析中发现，当所饲喂的1ml食物中含有50-500ngδ-内毒素蛋白时，对害虫具有明显的毒杀能力，然而当所饲喂的1ml食物中含有毫克级的植物蛋白酶抑制剂蛋白时，才能对害虫具有明显的毒杀能力(Koziel M.G.1993；Boulter D.1993；Shah D.M.1995)。由此看来，要想利用植物蛋白酶抑制剂基因进提高植物的抗虫能力，必须提高植物蛋白酶抑制剂基因在转基因植物中的表达水平。

在抗虫植物转基因工程中，提高外源基因的表达活性的主要途径是利用强启动子。但是我们认为除了利用外源的强启动子外，基因自身的结构(如内含子)也能影响基因的表达水平。目前，植物蛋白酶抑制剂基因在抗虫中的应用正逐渐受到国内外科学工作者的关注。在国内，植物蛋白酶抑制剂在抗虫工程中应用的研究主要集中于豇豆胰蛋白酶抑制剂基因和水稻胰蛋白酶抑制剂基因(刘春明1992)。在国外，有更多的植物蛋白酶抑制剂基因在抗虫研究中应用，但是国内外这些研究大都集中于这些基因cDNA杀虫活性的研究上。

基于上述观点，本研究利用PCR技术从番茄中首次分离了一种含有内含子的新型的番茄蛋白酶抑制剂II基因(tin2i)，同时也分离了该基因的cDNA序列，将这两类基因转化到烟草植株中，并比较了这两种序列在转基因植物中的表达活性。另外该基因的内含子能够提高目的基因的表达活性，并且这种提高具有增强子的特性。以期更为深入了解内含子在基因表达调控中的作用机理，同时更为重要的是为抗虫基因工程奠定了应用基础。

本发明的一个目的是提供一种能够提高结构基因表达的内含子。

本发明的再一个目的是提供一种含有本发明的内含子的结构基因。

本发明的又一个目的是提供一种增强结构基因表达活性的方法。

本发明的又一个目的是提供一种生物杀虫的方法。

本发明的又一个目的是提供一种提高植物抗虫活性的方法。

本发明提供了一种能够提高结构基因表达的内含子，它具有如下所示的核苷酸序列：

gtaagatttt cctttagtct cttttttttt ttttaaaaaa aagagaaaaa tattggttta

tacatacaca agtagtttta tatttttcct tatattatat ttgttgtag