[发明专利]海水鱼二联弧菌灭活疫苗的制备方法

说明书

本发明涉及人工养殖海水鱼疾病的预防用疫苗，具体说涉及海水鱼二联弧菌灭活疫苗的制备方法。

已有技术系用药物防治，由于长期使用药物会使鱼类产生耐药性，因而防治效果不佳。海水鱼养殖是我国海水养殖的第四次浪潮，为了防止疾病危害，必需及早研制养殖海水鱼的防病疫苗和实现疫苗的现场投予。研究发现，付溶血弧菌和鳗弧菌是引起海水鱼皮肤溃疡、眼球混浊及其它多种疾病的病原。

本发明的目的是提供一种能预防上述海水鱼疾病的二联弧菌灭活疫苗的制备方法。

本发明的另一目的是提供一种将灭活疫苗合理应用、即现场投予的方法。    

本发明的制备方法是先从病鱼体内分离出致病的付溶血弧菌和鳗弧菌两种病原，之后将上述病原菌在生物反应器中依一定的条件大量培养，再用福尔马林灭活，静置一天后离心收集，分别收到相应的菌体，使用时以1∶1比例将上述两种菌体混合，即为二联弧菌灭活疫菌。也就是将引起上述疾病的两种病原菌灭活，消除其对受免鱼的毒性，同时利用上述两种病原菌的抗原，使鱼类产生相应的抗体，从而达到预防疾病发生的目的。现场投予则灵活选择投喂免疫或浸泡免疫。

本发明是生物技术与鱼类免疫技术学的结合，方法简单、安全，产生的疫苗为灭活疫苗，免疫效果明显。而疫苗的现场投予合理方便，采用投喂和浸泡两种皆可。

本发明的制备方法，包括两种弧菌的分离、接种、斜面培养和利用生物反应器扩大培养及菌体灭活与收集，然后将两种灭活菌体按1∶1比例混合制成二联弧菌灭活疫苗使用。

本发明的具体方法如下：(1)首先选择2216-E作为培养基。将从病鱼体内分离的鳗弧菌和付溶血弧菌，分别接种到2216-E固体培养基斜面上，并在温度28±0.2℃下培养3-4天，待菌落生长旺盛时，即可用于生物反应器的扩大培养。

(2)先将高压灭菌后的2216-E液体培养基注入无菌的生物反应器中，鳗弧菌和付溶血弧菌分别培养，即将两种菌分别从前述斜面培养基上取菌落接种入生物反应器内。反应温度保持30±0.2℃，搅拌速度为600rpm，通气量为4L/min，培养24小时左右，即当反应器内溶氧量趋于平衡时，菌体生长达到高峰，停止反应。

(3)取出菌液，加入0.5％(v/v)福尔马林液，静置24小时。

(4)静置后，以4000rpm离心15分钟，分别收集沉积的、灭活后的付溶血弧菌和鳗弧菌菌体。

(5)最后将两种灭活菌按1∶1比例混合制成二联弧菌灭活疫苗使用。

在制备中还应考虑安全性检查以及灭活疫苗的保存。用灭菌生理盐水，将灭活后的上述两种菌体洗净、去除福尔马林。再用白金耳挑取少许菌体，在2216-E固体平板培养基上划线，在温度为28±0.2℃下培养3-4天，若无菌落出现，则证明灭活彻底。

该疫苗的保存方法系将二种灭活的菌体分别置于-20下冷冻保存。

作为其应用，可将制成的疫苗，即将灭活的鳗弧菌和付溶血弧菌二联疫苗进行现场投放，其方法有两种：

A、投喂免疫：将两种灭活疫苗各1克，加入每千克鱼体重所

   需的饲料中混匀，连续投喂10天。

B、浸泡免疫：将冻结的疫苗融化后，用海水稀释1000倍，

   用25升稀释后的疫苗浸泡50尾成鱼(幼鱼可浸泡80尾)，

   浸泡时间为5分钟左右。

疫苗免疫使用中，可根据现场具体情况选择A或B。显然本发明制备的灭活疫苗实用性强，制作和投予使用都简单合理，且免疫效果好，将广泛使用于海水养鱼场中，为我国海水鱼养殖事业的发展、尤其鱼类疾病防治做出新贡献。