[发明专利]N－乙酰神经氨酸的制造方法

说明书

本发明是有关利用具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性或N-乙酰神经氨酸合成酶活性的微生物，制造N-乙酰神经氨酸的制造方法的发明。

作为N-乙酰神经氨酸的制造方法已知有萃取法、分解法、利用酶催化的方法。

作为萃取法有从海燕窝萃取等方法[碳水化合物研究(Carbohydrate Research),56,423(1977)]。

作为分解法有对大肠杆菌等细菌生产的N-乙酰神经氨酸聚合物多聚乙酰神经氨酸进行分解等方法[生物化学杂志(J.Biochem.),82,1425(1977)]。

作为利用酶催化的方法有用N-乙酰神经氨酸醛缩酶、丙酮酸和N-乙酰甘露糖胺进行制造的方法[美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.),110,6481(1988)、J.Am.Chem.Soc.,110,7159(1988)]，有在碱性条件下用N-乙酰神经氨酸醛缩酶、丙酮酸和N-乙酰葡糖胺进行制造的方法[美国专利第5,665,574号]、用N-乙酰神经氨酸醛缩酶、N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶、丙酮酸和N-乙酰葡糖胺进行制造的方法[应用化学，国际英文版(Angew.Chem.Int.Ed.Eng.),30,827(1991)、Carbohydrate Research,306,575(1998)]、用N-乙酰神经氨酸合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸和N-乙酰甘露糖胺进行制造的方法[特开平10-4961、糖生物学(Glycobiology),7,697(1997)]。

无论上述N-乙酰神经氨酸的哪一种制造方法，由于操作都烦琐或者是必须使用高价的原料丙酮酸或磷酸烯醇式丙酮酸，所以还没有确立N-乙酰神经氨酸的成本低廉的制造方法。

到目前为止，有关利用微生物的培养物或该培养物的处理物可能制造N-乙酰神经氨酸的记载或提示还没有。

关于N-乙酰神经氨酸醛缩酶，已知有来自动植物的N-乙酰神经氨酸醛缩酶，微生物中已知属于埃希氏菌属的微生物也具有该酶活性。已知在属于埃希氏菌属(Escherichia)的微生物的大肠杆菌(Escherichia coli)中也有编码该酶的基因nanA[核酸研究(Nucleicacids Res.),13,8843(1985)]。

关于N-乙酰神经氨酸合成酶，已知属于埃希氏菌属、奈瑟氏球菌属、链球菌属的微生物中含有此酶，大肠杆菌中有编码该酶的基因nauB[细菌学杂志(J.Bacteriol.),177,312(1995)]。

关于N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶，已知在猪和大鼠中存在此酶，已就来自猪的该酶的性质进行了研究[生物化学(Biochemistry),17,3363(1970)]、已经获得了编码该酶的基因[生物化学杂志(J.Biol.Chem.),271,16294(1996)]。但到目前为止，具有该酶活性的微生物还不知道。

作为丙酮酸的制造方法已知有利用大肠杆菌的变异株制造丙酮酸的方法[生物科学.生物技术.生物化学(Biosci.Biotech.Biochem.),58,2164(1994)]。

作为磷酸烯醇式丙酮酸的制造方法有利用属于酵母属Saccharomyces微生物制造磷酸烯醇式丙酮酸的方法[特开平6-197778]。

本发明的目的是提供不添加丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸等高价原料，廉价制造N-乙酰神经氨酸的方法。另外还提供不用高价的N-乙酰甘露糖胺制造N-乙酰神经氨酸的方法。

本发明人为了解决上述课题进行了深入的研究，发现通过利用具有生产丙酮酸或磷酸烯醇式丙酮酸能力的微生物由价格便宜的原料可以高效生产N-乙酰神经氨酸，从而完成了本发明。

本发明包括以下(1)～(11)项内容。

(1)N-乙酰神经氨酸的制造方法，其特征是：使水介质中①含有具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶或N-乙酰神经氨酸合成酶活性的微生物的培养物或该培养物的处理物，②在上述①中使用具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的微生物时，含有具有丙酮酸生成能力的微生物的培养物或该培养物的处理物，在上述①中使用具有N-乙酰神经氨酸合成酶活性的微生物时，含有具有磷酸烯醇式丙酮酸生成能力的微生物的培养物或该培养物的处理物，③含有N-乙酰甘露糖胺、以及④丙酮酸或磷酸烯醇式丙酮酸生成时所必需的能源，使N-乙酰神经氨酸在该水介质中生成、蓄积，从该水介质中提取N-乙酰神经氨酸。