[发明专利]一种利用中国红豆杉细胞生产紫杉烷类的方法

说明书

本发明涉及紫杉烷的生产方法，具体地说涉及用植物细胞培养技术生产紫杉烷的方法。    

云南紫杉烷(Taxuyunnanine C,Tc)与紫杉醇同属于三环二萜类化合物，文献：(1994)Taxanes from Taxus chinensis.Phytochemistry.38:667-670.报道了该化合物，其结构式如下：

紫杉烷Tc(简称Tc)被推测是紫杉醇生物合成途径中的中间代谢物，它们可以作为合成紫杉醇或其它有用物质的前体，其本身的药用价值也正在研究和开发之中(王红强博士论文，华东理工大学，1998)。利用红豆杉细胞培养高产紫杉烷作为化学半合成紫杉醇的前体具有潜在的商业生产价值。

自从紫杉醇的临床抗癌活性被发现以来，紫杉醇以及相关的紫杉烷类化合物受到人们越来越多的关注。到目前为止，已分离得到一百多种紫杉烷，并发现一些紫杉烷类具有和紫杉醇相似的活性。美国食品及药物管理局(FDA)于1992年底正式批准紫杉醇可用于治疗晚期卵巢癌患者。到目前为止，已有十多个国家批准紫杉醇可用于癌症的治疗。但是，全世界紫杉属植物资源很有限，而对其的需求量极大。据估计，全世界每年需要500kg的紫杉醇才能满足广大癌症患者的需求。若光从树皮中提取紫杉醇，每年需砍伐150-200万棵左右的大树。即使按全世界每年需要50kg紫杉醇计算，全世界红豆杉属植物也仅够砍伐10-15年。如此大量砍伐将对红豆杉属植物的长期存留和地区分布带来严重的威胁，造成生物多样性和生态环境的极大破坏和无法弥补的损失。所以，研究紫杉醇的其它来源已成为当务之急。同人工栽培红豆杉属植株或化学全合成紫杉醇等方法相比，专利：Japan Patent WO 95/14103、US Patent 5407816等报道的细胞培养法生产紫杉烷类物质由于生产周期短、劳动力省、成本低以及受外部环境影响小等优点通常被认为是一种比较有效的方法。但是用植物细胞培养技术生产紫杉醇目前仍然存在生产效率低的问题，达不到工业化生产的要求。诱导剂由于其具有的能够刺激植物细胞次级代谢的能力而被用来进一步提高植物细胞的生产能力，文献：(1996)Methyl jasmonate-induced overproduction of paclitaxel and baccatin Ⅲ inTaxus cell suspension cultures.Nat.Biotechnol.14:1129-1132.和(1999)The kineticsoftaxoid accumulationin cell suspension cultures of Taxus following elicitation withmethyl jasmonate.Biotechnol.Bioeng.62:97-105.报道了茉莉酮酸类物质能够促进紫杉烷类物质的产生。但是利用诱导法来提高云南紫杉烷(Tc)生产能力的研究还未见报道。

本发明的目的在于提供一种利用中国红豆杉细胞(Taxus chinensis)的悬浮培养，通过诱导剂的诱导和补糖添加组合起来的生产云南紫杉烷(Tc)的新方法，十分显著地提高了Tc的生产效率，克服了现有技术的缺陷。

实现本发明的技术方案包括如下步骤：

(1)中国红豆杉细胞的培养：

将从植株幼茎外植体诱导愈伤组织中分离获得的中国红豆杉(T.chinensis)细胞，移入液体培养基中采用常规的方法进行继代培养，该制备过程为一现有技术，在文献：(1997)Enhanced production oftaxol in suspension cultures of Taxuschinensis by controlling inoculum size.19:353-355.文献中对该过程已有详细的描述；培养基采用该文献公开的Murashige-Skoog(MS)培养基，另添加0.1-1.0mg/L6-苄基腺嘌呤，0.05-0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，0.05-0.5mg/L萘乙酸，20-500mg/L抗坏血酸及10-50g/L蔗糖。每隔14天传代一次，培养使用旋转式摇床，转速为60-200rpm，培养温度20-30℃，暗培养，接种量为20-200g/L湿重。

(2)Tc的生产：