[发明专利]使用棒状细菌发酵制备D－泛酸的方法

说明书

本发明涉及使用至少扩增了pyc基因的棒状细菌发酵制备D-泛酸的方法。

泛酸是用于化妆品，药品，人类营养和动物营养的商业上重要的维生素。

泛酸可经过化学合成，或经过在合适的营养溶液中发酵合适的微生物经过生物技术来制备。在化学合成中，DL-泛内酯是重要的中间阶段。它在多步过程中从甲醛，异丁醛和氰化物制备。在另外加工步骤中，分离外消旋混合物，将D-泛内酯与β-丙氨酸进行缩合反应，以这种方式获得所需的D-泛酸。

以微生物进行发酵制备的优势在于直接形成所需的立体异构D-型，它游离于L-泛酸。

许多类型的细菌，例如，大肠杆菌，产脲节杆菌，产红棒杆菌，产氨短杆菌，还有酵母，如Debaromyces castellii可在含有葡萄糖，DL-泛解酸和β-丙氨酸的营养溶液中产生D-泛酸，如在EP-A0493060中所示。EP-A0493060还表明对于大肠杆菌，经过扩增包含在质粒pFV3和pFV5中的大肠杆菌泛酸生物合成基因可在含有葡萄糖，DL-泛解酸和β-丙氨酸的营养溶液中促进D-泛酸的形成。

EP-A0590857和美国专利5518906描述了来自大肠杆菌菌株IFO3547的突变体，例如，FV5714，FV525，FV814，FV521，FV221，FV6051和FV5069，它们携带对各种抗代谢物，例如，水杨酸，α-丁酮酸，β-羟基天冬氨酸，O-甲基苏氨酸和α-酮异戊酸的抗性。它们在含有葡萄糖，和D-泛酸的营养溶液中和在含有葡萄糖和β-丙氨酸的营养溶液中产生泛解酸。在EP-A0590857和美国专利5518906中还表明扩增包含在质粒pFV31中的泛酸生物合成基因后促进上述菌株在含有葡萄糖的营养溶液中产生D-泛解酸和在含有葡萄糖和β-丙氨酸的营养溶液中生产D-泛酸。

本发明人的目的是为用棒状细菌发酵制备泛酸的改进方法提供新的措施。

维生素泛酸是用于化妆品，药品，人类营养和动物营养的商业上重要的产品。对于提供制备泛酸的改进方法普遍感兴趣。

在下文中提到D-泛酸或泛酸或泛酸盐时，不仅指D-泛酸的游离酸，还指其盐，例如，钙，钠，铵或钾盐。

本发明提供了使用棒状细菌发酵制备D-泛酸的方法，其中编码丙酮酸羧化酶(EC号6.4.1.1.)的核苷酸序列(pyc基因)被扩增，特别是过量表达。

采用的菌株任选在扩增pyc基因前已能产生D-泛酸。

优选的实施方案参见权利要求书。

本文中术语“扩增”描述了微生物中由相应DNA编码的一种或多种酶的细胞内活性增加，例如，经过增加一个或多个基因的拷贝数，使用有效启动子或使用编码具有高活性的相应酶的基因，和任选组合这些方法。

本发明提供的微生物可从葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖浆，淀粉，纤维素或从甘油和乙醇产生D-泛酸。它们是棒状细菌的代表，特别是棒杆菌属。在棒杆菌属中，特别提及的是谷氨酸棒杆菌种，本领域技术人员已知其产生L-氨基酸的能力。

棒杆菌属特别是谷氨酸棒杆菌种中合适的菌株是，例如，已知的野生型菌株

谷氨酸棒杆菌ATCC13032

醋谷棒状细菌ATCC15806

嗜乙酰乙酸棒状细菌ATCC13870

嗜热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)FERMBP-1539

黄色短杆菌ATCC14067

乳发酵短杆菌ATCC13869和

扩展短杆菌ATCC14020

和从它们制备的产D-泛酸的突变体。

已发现棒状细菌在过量表达编码丙酮酸羧化酶(EC号6.4.1.1.)的pyc基因后以增加的方式产生泛酸。

pyc基因编码催化丙酮酸羧化成草酰乙酸的丙酮酸羧化酶(EC号6.4.1.1.)。pyc基因的核苷酸序列在DE-A-19831609中公开并且也被Koffas等(应用微生物学和生物技术50,346-352(1998))和Peters-Wendisch等(微生物学144,915-927(1998))描述。它一般可从国家生物技术信息中心(NCBI,Bethesda,MD,USA)核酸序列数据库中以登记号Y09548获得。根据本发明可使用所述参考文献描述的pyc基因。还可使用由于遗传密码的简并性或由于中性功能的有意义突变产生的pye基因的等位基因。