[发明专利]一种新的提取纯化羊胎素工艺和检测其生物活性的方法

说明书

本发明涉及生物制药技术，尤其涉及一种新的提取纯化羊胎素工艺和检测其生物活性的方法。

羊胎盘中含有近百种促进机体组织细胞代谢和修复的有效成份，随着近年来生物制药技术的进步，获得较纯的羊胎盘内的蛋白和多肽组分已成为可能，然而目前所采用的传统提取方法为从食品工艺中衍生过来的方法，(如中国专利申请号98101188和98115761所述)，不仅仅过于粗糙，提取的所谓的羊胎素实际上是羊胎盘中所有的结构蛋白质和功能蛋白质及多糖的混合物，具有免疫原性，根本不能药用，同时由于酶降解、蛋白质变性、温度变化等因素的影响，所提取的物质生物活性差、专一性弱只用于美容化妆等行业，可以说用现有的方法提取羊胎素，不仅提取不到羊胎素而且浪费了大量的宝贵的羊胎盘资源。

本发明的目的就是为了克服现有羊胎素提取方法的缺陷，而提供的一种具有纯度高、匀一性好、生物活性强和得率多、成本低等特点的一种新的提取纯化羊胎素工艺和检测其生物活性的方法。

实现本发明目的的技术方案是：

一种新的提取纯化羊胎素工艺，其特点是，包括：抽提和盐析、超滤和脱盐、透析和浓缩、以及羧甲基纤维素葡聚糖凝胶阳离子交换层析(以下简称CM-SephadexC₅₀柱层析)四个步骤；

所述的抽提和盐析的步骤包括：

将新鲜或冷冻的羊胎剪除胎膜和大血管，洗净残余的血块，切碎，再在组织捣碎机中反复捣碎，制成匀浆；将该匀浆在冰浴中搅拌，弃沉淀，取上清液再搅拌，盐析沉淀，即得到含有羊胎素的粗提物；

所述的超滤和脱盐的步骤包括：先在截留值为30000千道尔顿～4000道尔顿的过滤机中初滤，再在摄氏0-15度的低温条件下采用截留值为100道尔顿～800道尔顿的过滤机进行分级超滤和脱盐；

所述的透析和浓缩的步骤包括：将粗提物用少量冷去离子水溶解后，再彻底透析；收集透析液并浓缩，计算总体积，测定蛋白质浓度；

所述的CM-SephadexC₅₀柱层析步骤包括：将羊胎素粗提物浓缩液透析，然后上样于预先用同样缓冲液平衡过的CM-SephedexC₅₀(2.5×50cm)柱进行洗脱，得到第一个蛋白峰；待该蛋白峰下降至基线位置时，再递次用上述磷酸盐缓冲液洗脱，分别可得到第二个蛋白峰和第三个蛋白峰；分别收集上述CMF₁、CMF₂和CMF₃组份，分别命名为羊胎素1，羊胎素2和羊胎素3待测其蛋白质浓度和生物活性。

上述一种新的提取纯化羊胎素工艺，其中，所述的将羊胎盘制成匀浆的要求是：在1℃～6℃的条件下，每公斤组织块加入含0.5mmol/L苯甲基璜酰氟(以下简称PMSF)的0.15mol/L硫酸铵溶液2L，在组织捣碎机中反复捣碎3分钟，制成匀浆。

上述一种新的提取纯化羊胎素工艺，其中，所述的透析是将粗提物用少量冷去离子水溶解后，置于截留值＜4000的透析袋内，在1℃-4℃下不断搅拌，对水彻底透析。

一种检测羊胎素生物学活性的方法，其特点是，包括分子量测定和氨基酸组成分析两大步骤；

所述的分子量测定是采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰铵凝胶电泳法，其步骤为：将标准蛋白和待测蛋白样品加入等体积的样品缓冲液中混匀后，加热，然后按预定顺序电泳；当样品开始进入上层胶中时，逐渐被浓缩；当染料前沿进入分离胶时，并达到分离胶底部时，剥胶并标记；脱色后测量从分离胶起始处到标记染料区带及蛋白区带中心位置的距离；然后以标准蛋白分子量对数为纵坐标，以相对迁移率(Rm)为横坐标，在半对数坐标纸上作出标准曲线；根据待测蛋白的Rm值在标准曲线上算出其对应的分子量。

所述的氨基酸组成分析方法在基酸自动分析仪上进行。

所述的羊胎素组份生物活性的测定采用氚-胸腺嘧啶核苷(以下简称³H-TdR)掺入法进行，其步骤为：