[发明专利]一种新的提取纯化羊胎素工艺和检测其生物活性的方法

权利要求书

1、一种新的提取纯化羊胎素工艺，其特征在于，包括：抽提和盐析、超滤和脱盐、透析和浓缩、以及羧甲基纤维素葡聚糖凝胶阳离子交换层析四个步骤；

所述的抽提和盐析的步骤包括：

将新鲜或冷冻的羊胎剪除胎膜和大血管，洗净残余的血块，切碎，再在组织捣碎机中反复捣碎，制成匀浆；将该匀浆在冰浴中搅拌，弃沉淀，取上清液再搅拌，盐析沉淀，即得到含有羊胎素的粗提物；

所述的超滤和脱盐的步骤包括：先在截留值为30000千道尔顿～4000道尔顿的过滤机中初滤，再在摄氏0-15度的低温条件下采用截留值为100道尔顿～800道尔顿的超滤器进行分级超滤和脱盐；

所述的透析和浓缩的步骤包括：将粗提物用少量冷去离子水溶解后，再彻底透析；收集透析液并浓缩，计算总体积，测定蛋白质浓度；

所述的羧甲基纤维素葡聚糖凝胶阳离子交换层析步骤包括：将羊胎素粗提物浓缩液透析，然后上样于预先用同样缓冲液平衡过的羧甲基纤维素葡聚糖凝胶阳离子交换层析柱进行洗脱，得到第一个蛋白峰；待该蛋白峰下降至基线位置时，再递次用上述磷酸盐缓冲液洗脱，分别可得到第二个蛋白峰和第三个蛋白峰；分别收集上述CMF₁、CMF₂和CMF₃组份，分别命名为羊胎素1，羊胎素2和羊胎素3待测其蛋白质浓度和生物活性。

2、根据权利要求1所述的一种新的提取纯化羊胎素工艺，其特征在于，所述的将羊胎盘制成匀浆的要求是：在1℃～6℃的条件下，每公斤组织块加入含0.5mmol/L苯甲基璜酰氟的0.15mol/L硫酸铵溶液2L，在组织捣碎机中反复捣碎3分钟，制成匀浆。

3、根据权利要求1所述的一种新的提取纯化羊胎素工艺，其特征在于，所述的透析是将粗提物用少量冷去离子水溶解后，置于截留值＜4000的透析袋内，在1℃-4℃下不断搅拌，对水彻底透析。

4、一种检测羊胎素生物学活性的方法，其特征在于，包括分子量测定和氨基酸组成分析两大步骤；

所述的分子量测定是采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰铵凝胶电泳法，其步骤为：将标准蛋白和待测蛋白样品加入等体积的样品缓冲液中混匀后，加热，然后按预定顺序电泳；当样品开始进入上层胶中时，逐渐被浓缩；当染料前沿进入分离胶时，并达到分离胶底部时，剥胶并标记；脱色后测量从分离胶起始处到标记染料区带及蛋白区带中心位置的距离；然后以标准蛋白分子量对数为纵坐标，以相对迁移率(Rm)为横坐标，在半对数坐标纸上作出标准曲线；根据待测蛋白的Rm值在标准曲线上算出其对应的分子量。

所述的氨基酸组成分析方法在基酸自动分析仪上进行。

所述的羊胎素组份生物活性的测定采用氚-胸腺嘧啶核苷掺入法进行，其步骤为：

取成纤维细胞经0.25％胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，接种于培养板上，24小时后换培养液，置于37℃，5％CO₂饱和湿度条件下继续培养；次日加入倍比稀释的羊胎素不同组份，同条件下继续培养。48小时后结束培养，倾去培养液，加入0.25％胰蛋白酶消化3min，多头细胞搜集器收集细胞于玻璃纤维滤片上，水洗后固定，再烘干，置闪烁液中，通过仪器测各样品管的cpm值；再以含羊胎素组份的蛋白质浓度为横坐标，以每孔的cpm数为纵坐标，描记氚-胸腺嘧啶核苷掺入曲线，其中一个活性单位(ED₅₀)定义为最大刺激活性一半时所需的羊胎素组份的含量。

5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的缓冲液由10％聚乙酰胺12-烷基磺酰钠、1％硫基乙醇、0.01mol/LPH7.8磷酸钠构成。

6、根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的电泳的电泳体系是：浓缩胶浓度为3％，PH：6.8，分离胶浓度为15％，PH：8.8。

7、根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的浓缩时间约为40分钟-50分钟。

8、根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的

9、根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的闪烁液为0.3％PPO和0.03％POPOP的甲苯溶液。