[发明专利]一种大片段DNA制备乳腺生物反应器新方法

说明书

本发明涉及基因工程领域和药物领域，更具体地，本发明涉及制备乳腺生物反应器的制备方法，尤其是用大片段DNA制备乳腺生物反应器的方法。

乳腺生物反应器制药是80年代末90年代初兴起的新兴技术。这项技术原理是将人药用蛋白基因转入乳用家畜体内，药用蛋白在家畜乳腺中表达，进而在乳汁中提取蛋白。与细菌表达重组蛋白及哺乳动物细胞表达方法相比，该方法有明显优势，例如生产的蛋白不但可以表达较大的蛋白，以复杂的糖基化进行修饰，产生正常的生理活性，而且产量大、生产成本低，因而此技术有着广阔的市场前景。

自90年以来乳腺生物反应器先后成功表达了抗胰蛋白酶，纤溶酶原，凝血因子九，血浆白蛋白等药用蛋白，并打入了药品市场，现在每年产值近十亿美元。

但是随着该技术的大规模应用，一些技术难题渐渐显现出来。其中最突出的是转基因表达的位点效应，即转基因在基因组中随机整合，但只有整合在活化的染色质区才能表达；这样只有10-20％的转基因整合动物的才会不同程度的表达目标蛋白，而且表达量相差显著，这就大大提高了生产转基因动物的成本，使得该技术产业化困难。

为了克服位点效应各国科学家作了多年的研究，发现乳蛋白基因的5′和3′调控区远端存在基因座控制区(locus control region，简称为“LCR”)或基质附着区(matrix attachment region，简称为“MAR”)[Jew P cell 1992][Kioussis.D,Curr Opin Genet Develop 1997][Blackwood,Science 1998]，这些序列的存在可以克服转基因表达中的位点效应。但是乳蛋白的LCR序列大多位于基因上下游的几十KB的范围内，如果用质粒来克隆如此大的DNA片段是不可能的，因为质粒的克隆能力在15KB以内。

以YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)和P1人工染色体技术为代表的大片段DNA转基因技术的发展，提供解决了这一难题的可能。这些载体可以克隆长达几百KB的DNA片段，可以一次克隆下乳蛋白基因的上下游远端几十KB的调控序列。实验已表明用BAC、YAC载体构建的大片段DNA消除了转基因表达中的位点效应，而且明显体现了转基因拷贝数与目标蛋白表达的正相关性，转基因整合的拷贝数越多，表达量越高[Keneth,PNAS 1993]。这些载体不仅克隆能力很强，而且在细菌中和酵母内的同源重组率高[Xiangdong W,Nature Biotechnology 1997]，因而对BAC、YAC分子同源重组改造方便，可以向YAC中重组引入筛选标志，酶切位点等，并可以将目标蛋白基因转入YAC转基因载体中或突变YAC中的基因，酵母中成熟的分子克隆技术促进了YAC载体在转基因领域的应用。

近年来，大片段DNA转基因技术应用越来越广泛，从大基因组基因的功能研究到建立疾病模型都有应用例[Keneth PNAS 1993]。在90年代中后期大片段DNA转基因技术渐渐应用起来。    

97年-99年日本科学家Y.Fujiwara等第一次将YAC载体引入乳腺生物反应器的研究中，97年用含乳清白蛋白基因的YAC DNA(210KB)转基因，得到了乳清白蛋白表达量高达2-3ml/ml。98年又进一步对YAC进行酵母内同源重组，成功地完成了重组YAC DNA的转基因。目标蛋白生长激素的表达量可达0.8mg/ml。

1999年法国的Marie-Georges研究组成功应用了170KB的BAC DNA乳腺表达了羊乳清白蛋白，表达量可达0.8-1mg/ml。

Y.Fujiwara和Marie-Georges的成功提示大片段DNA转基因在乳腺生物反应器领域的应用将领导乳腺制药领域的技术潮流。应用该技术有利于基因表达调控的进一步深入研究；揭示基因基因定位高效表达的分子机理；促进乳腺制药产业的发展。

然而，目前的大片段DNA制备乳腺生物反应器的技术仍存在一些缺点，如由于大片段DNA转基因构建过程的复杂性和操作过程的难度大，所以目前世界上还只有两三个实验室作该领域工作；而且只能表达一些长度在10kb以内较小的目的基因；还只能应用该技术生产转基因小鼠，还没有该技术生产转基因大动物的先例。

本发明的目的就是提供一种新的用大片段DNA制备乳腺生物反应器的方法，该方法具有至少如下一个或多个优点：

1．简化了大片段DNA转基因构建方法，使其程式化，促进了在乳腺制药工业的应用。