[发明专利]一种大片段DNA制备乳腺生物反应器新方法

权利要求书

1、一种用大片段DNA制备乳腺生物反应器的方法，其特征在于，它包括步骤：

制备BAC、YAC和P1载体上的含目的基因的大片段DNA，其中大片段DNA上的目的基因在山羊乳腺中定点表达；

用原核注射法将大片段DNA注射入山羊受精卵内，

移植到代孕山羊体内，产生转基因的山羊，大片段DNA上的目的基因在山羊乳腺中定点表达。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该目的基因编码乳铁蛋白，而且将含乳蛋白基因的大片段直接用于转基因。

3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该大片段DNA通过酵母内同源重组的方法进行改造，从而在该大片段DNA中乳蛋白基因的调控序列位于目的基因的两侧并指导目的基因的表达。

4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在用酵母内同源重组的方法改造大片段DNA时，包括步骤：

用聚合酶链式反应方法调取乳蛋白基因上下游各一段300-1500bp调控序列作为同源臂，两者之间插入要表达的目的基因构建成打靶载体。

5、如权利要求4所述的方法，其特征在于，还包括步骤：

将所述的打靶载体，与含有乳蛋白基因大片段上下游序列及基因自身的完整编码序列的大分子YAC、BAC、P1克隆进行酵母内重组，从而将目的基因插入在乳蛋白基因的大片段调控序列下。

6、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该大片段DNA包括长度为5-200kb的含目的基因的基因组序列，和位于所述基因组序列两侧并指导目的基因表达的长度为50-200KB的乳蛋白基因的调控序列。

7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的乳蛋白基因的调控序列包括乳蛋白基因编码区的5′和3′序列，其上包括如下控制乳蛋白基因转录的核心序列：TATA盒、GC盒，远端基因座控制区。

8、根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的大片段DNA是用酵母内YAC嵌合方法制备的。

9、如权利要求8所述的方法，其特征在于，用酵母内YAC嵌合方法制备大片段DNA时包括步骤：

制备乳腺定位表达ALA的表达载体和含目的基因的基因组序列的表达载体；

用聚合酶链式反应方法调取乳蛋白基因上下游各一小段300-1500bp调控序列和目的基因的头尾各一小段300-1500bp序列，用同源重组方式将所述的乳蛋白基因上下游各一小段调控序列分别插入所述目的基因的头尾各一段序列的上下游，形成两个嵌合载体；

嵌合载体与所述的含目的基因的基因组序列的表达载体进行同源重组，形成目的基因嵌合载体，其中所述的乳蛋白基因上下游各一小段调控序列位于目的基因的两侧；

将目的基因嵌合载体与乳腺定位表达乳蛋白的表达载体转入同一酵母中，两者重组形成嵌合分子，其中该嵌合分子上乳蛋白基因大片段上下游序列指导目的基因的基因组序列的表达。

10、如权利要求1所述的方法，其特征在于，该目的基因编码选自下组的蛋白：HLF、IL-11、FIX，且该山羊选自下组：莎能乳山羊、波尔羊、普通山羊。