[发明专利]一种中国人白细胞介素－18亚型(53ArgIL－18)的基因克隆、产物的制备及应用

说明书

本发明属生物技术领域，涉及一种中国人白细胞介素-18(IL-18)亚型的基因克隆、产物的制备和含有人白细胞介素-18的制剂作为治疗人类恶性肿瘤及自身免疫性疾病的治疗药物。

1.  1995年Okamura首次在鼠的肝脏中分离到一个新的、诱导IFN-γ产生的细胞因子，并将其称为IGIF，它的分子量为18.3kD，等电点为4.9，根据所测定的氨基酸序列合成寡核苷酸引物，利用RT-PCR扩增得到IGIF的部分基因，并以此为探针从鼠肝脏的cDNA文库中筛选出IGIF的全长基因(Coning ofa new cytokine that induces IFN-production by T cell.Nature1995，378：88)，同年，Ushio以鼠的IGIF为探针从人肝脏cDNA文库中筛选出人的IGIF的全长基因(Cloning of the cDNA for human IFN-inducing factotexpression in escherichia coli，and studies on the biologic activitiesof the protein.J.Immunol.1996，156：4274-4279)，以后将其命名为IL-18。鼠白细胞介素18(mIL-18)前体是由192个氨基酸组成，为mIL-18的前体蛋白，其N端含有一特殊的前导序列，由35个氨基酸组成，无N-糖基化位点。人白细胞介素18(hIL-18)的前体蛋白是由193个氨基酸组成，它的氨基酸序列与mIL-18的氨基酸序列同源性为65％。对IL-18的序列分析发现它含有IL-1的特征序列，因此有人将IL-18也称为IL-1γ(A newly defindedinterleukin-1？Nature1996.375：591)。

IL-18最早发现是在Kupffer细胞和活化的巨噬细胞，现已在许多组织如：胰腺、肾脏、骨骼肌、肝脏、肺、皮肤[Production of IL-18(IFN-gamma-inducing-factor)messenger RNA and functional protein by murinekeratinocytes.J.Immunol 1997，159：298-302]都能检测到IL-18mRNA的存在，但这些组织是否有IL-18蛋白的表达还有待进一步的证实。

2.成熟的人IL-18是由157个氨基酸组成。IL-18与IL-12在功能上呈现一些共同的生物活性，但其作用的方式不同，IL-18比IL-12有更强的诱导IFN-γ的作用，能加强FasI，介导T1辅助细胞的细胞毒性(CellImmunol.1996.173：230)，并能增强IL-2与GM-CSF的活性，因此推测IL-18可能对增强免疫、抗肿瘤及造血功能有重要作用，在临床上有潜在的应用前景，为了对IL-18的功能进行深入的研究，我们利用RT-PCR技术从中国人的外周血细胞得到了编码人的IL-18的一种亚型的cDNA片段，这种亚型目前尚未见文献报道，cDNA组入表达载体获得了高效表达。表达产物具有明显的生物活性，这为进一步研究IL-18的功能和临床应用奠定了基础。

本发明采用下述技术方案：

1.用植物凝集素(PHA)刺激人外周血淋巴细胞，提取总RNA，通过RT-PCR的方法扩增得到不含信号肽的人白细胞介素-18的基因片段，该片段与pUC19连接，测序表明第53个氨基酸与文献报道序列不一致，将PCR扩增产物插入国内广泛采用的高效表达载体pBV220中，构建成人IL-18表达质粒pIL-18。它能在大肠杆菌HB101和DH5α中高表达，使IL-18占菌体总蛋白的30-40％，表达率经100次以上传代不降低。

2.通过发酵工程菌，用2YT作为基础培养基，适当增加碳源和氮源，通过优化溶氧、搅拌速度、发酵pH值等工艺参数，最终培养物OD₆₀₀值可达25左右，生物量为每升培养物30-35g，产物表达率在30-40％之间。产物表达量可达每升培养物300mg以上。

3.在此基础上建立了纯化工艺，其中包括菌体的破碎和包涵体抽提、凝胶排阻层析、复性和阴离子交换层析精制等。