[发明专利]重组人硒蛋白P基因表达纯化方法及专用引物与培养基

说明书

本发明涉及基因工程领域人体蛋白基因的表达纯化方法与专用引物及培养基，特别是重组人硒蛋白P基因的表达纯化方法与专用引物及专用培养基。

原核细胞和动物细胞的硒蛋白均含有硒半胱氨酸，如原核细胞的甲酸脱氢酶、动物细胞的谷胱甘肽过氧化物酶、甲状腺原氨酸脱碘酶、硒蛋白P等。各种硒蛋白的活性中心均决定于硒半胱氨酸，硒半胱氨酸在其基因阅读框架中均编码为TGA，而TGA在一般蛋白的翻译时作为终止密码。已发现的动物细胞硒蛋白中，绝大多数蛋白的多肽链含一个硒半胱氨酸。人硒蛋白P(HSEP)是在人血浆中发现的富硒蛋白，具有多种抗氧化功能，而人硒蛋白P却含有十个硒半胱氨酸，即其基因阅读框架中有十个终止密码TGA，这给用基因工程方法表达人硒蛋白P基因带来了非常大的困难。本发明的发明人通过基因重组的方法，构建了一种重组人硒蛋白P，其在3′端非编码区内包括干环部分，使在转录基因不变的情况下，阅读时不受终止密码的控制。该重组基因的序列发表于Hill KE：PNAS,1993 vol.90,pp537-541；Yasui Y,Yang JG：Gene,1996 vol,pp269-270。

本发明的目的是提供一种上述重组人硒蛋白P基因表达纯化的方法。

本发明的技术方案为：一种表达纯化重组人硒蛋白P基因的方法，包括以下步骤：

(1)、克隆人硒蛋白P的基因，用反转录PCR法扩增硒蛋白P的基因；

(2)、将上述扩增的硒蛋白P基因与克隆载体连接，构建人硒蛋白P克隆质粒；

(3)、将上述人硒蛋白P克隆质粒亚克隆进表达载体，再将连接后的质粒DNA转染大肠杆菌；

(4)、表达全长人硒蛋白P

a、将上述带有人硒蛋白P基因的表达载体的大肠杆菌铺含有抗生素的LB培养基板，将板放置37℃温箱过夜培养；

b、从板上选一个菌落，放入装LB培养基培养瓶内，在30℃摇箱内培养，测菌液A₆₅₀ OD值为0.5时停止培养；

c、将上述菌液放入装有富硒培养基的培养瓶内，在37℃摇箱内培养5小时，测菌液A₆₅₀ OD值，当OD值为1.0时，向菌液内加IPTG(异丙基-B-D-硫代半乳糖苷)，使其终浓度为0.5mM，继续培养6-8小时；

d、收获细菌；

(5)、纯化人硒蛋白P

a、将上述细菌沉淀用pH8.0的磷酸盐缓冲液洗一次，离心后，再用pH8.0的磷酸盐缓冲液悬浮沉淀；

b、裂解细菌，离心取上清液；

c、初步纯化人硒蛋白P；

d、用金属镍螯合剂亲和层析进行纯化。

本发明的另一目的是提供一种重组人硒蛋白P基因表达纯化中的专用引物及专用培养基。

本发明专用引物的基因序列为

引物15′GTGGTTGTGACAACCCCAGC 3′

引物25′AATGGAAAGCATGTCTTTGT 3′

本发明的专用培养基，由下列配方组成：

    富硒酵母提取物    10克

    蛋白冻            16-20克

    亚硒酸钠          1-20微克

    氯化钠            10克

    加无离子水至1000毫升

本发明由于采用了上述方法，特别是由于采用了本发明的专用引物及专用培养基，使重组人硒蛋白P基因能够得到表达和纯化，为对人硒蛋白P的进一步科学研究及批量生产奠定了基础。

下面结合附图对本发明的实施例作进一步说明。

图1为纯化的人硒蛋白P的电泳图

实施例：

一、人硒蛋白P基因cDNA的获得

1、取2克人胎儿肝细胞，采用美国Trizol RNA抽提试剂盒推荐方法提取总RNA，将总RNA走变性胶，确认总RNA的质量可靠；

2、设计引物如下：

引物15′GTGGTTGTGACAACCCCAGC 3′

引物25′AATGGAAAGCATGTCTTTGT 3′

3、以上述总RNA为模版，PCR反转录合成人硒蛋白P的cDNA,PCR反应体系参照文献(Scarf S.J.,In PCR Protocol：A Guide to Method andApplication,and ed.New York,Academic Press,USA 1990)进行，反应条件为：

94℃变性50秒，

55℃退火1分钟，