[发明专利]重组人硒蛋白P基因表达纯化方法及专用引物与培养基

权利要求书

1、一种表达纯化重组人硒蛋白P基因的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)、克隆人硒蛋白P的基因，用反转录PCR法扩增硒蛋白P的基因；

(2)、将上述扩增的硒蛋白P基因与克隆载体连接，构建人硒蛋白P克隆质粒；

(3)、将上述人硒蛋白P克隆质粒亚克隆进表达载体，再将连接后的质粒DNA转染大肠杆菌；

(4)、表达全长人硒蛋白P

a、将上述带有人硒蛋白P基因的表达载体的大肠杆菌铺含有抗生素的LB培养基板，将板放置37℃温箱过夜培养；

b、从板上选一个菌落，放入装LB培养基培养瓶内，在30℃摇箱内培养，测菌液A₆₅₀ OD值为0.5时停止培养；

c、将上述菌液放入装有富硒培养基的培养瓶内，在37℃摇箱内培养5小时，测菌液A₆₅₀ OD值，当OD值为1.0时，向菌液内加IPTG(异丙基-B-D-硫代半乳糖苷)，使其终浓度为0.5mM，继续培养6-8小时；

d、收获细菌；

(5)、纯化人硒蛋白P

a、将上述细菌沉淀用pH8.0的磷酸盐缓冲液洗一次，离心后，再用pH8.0的磷酸盐缓冲液悬浮沉淀；

b、裂解细菌，离心取上清液；

c、初步纯化人硒蛋白P；

d、用金属镍螯合剂亲和层析进行纯化。

2、根据权利要求1所述的表达纯化重组人硒蛋白P基因的方法，其特征在于：所述反转录PCR法扩增硒蛋白P的基因所用的引物为

引物15′GTGGTTGTGACAACCCCAGC 3′

引物25′AATGGAAAGCATGTCTTTGT 3′

3、根据权利要求1或2所述的表达纯化重组人硒蛋白P基因的方法，其特征在于：所述将人硒蛋白P克隆质粒亚克隆进表达载体的方法为：表达载体为任一表达载体；用一对上游和下游的5′端各带有和表达载体相对应的二个限制性内切酶位点的引物，以人硒蛋白P克隆质粒DNA为模板，做PCR扩增；将PCR产物用常规方法进行纯化；用二个相应的限制性内切酶对PCR产物和表达载体进行酶切，用常规方法纯化酶切后的PCR产物和表达载体；用T4连接酶将纯化的PCR产物和表达载体连接。

4、根据权利要求1或2所述的表达纯化重组人硒蛋白P基因的方法，其特征在于：所述将人硒蛋白P克隆质粒亚克隆进表达载体的方法为：表达载体为任一表达载体；选用克隆载体和表达载体上相同的限制性内切酶位点。用一个限制性内切酶对克隆载体和表达载体酶切，切出克隆载体内的硒蛋白P基因序列，切去表达载体内的多克隆位点序列；用常规方法纯化硒蛋白P基因序列和切去表达载体内多克隆位点序列的表达载体；用T4连接酶将纯化的人硒蛋白P基因序列和表达载体连接。

5、根据权利要求1或2所述的表达纯化重组人硒蛋白P基因的方法，其特征在于：在所述表达全长人硒蛋白P的过程中，LB培养基中加入的抗生素为氨苄青霉素；收获细菌的方法为将培养物以3000转/分离心20分钟，去上清液，收集沉淀。

6、根据权利要求1或2所述的表达纯化重组人硒蛋白P基因的方法，其特征在于：在所述纯化人硒蛋白P的步骤中，用磷酸盐缓冲液洗洗细菌沉淀后，离心的速度为5000转/分，持续5分钟；细菌裂解的方法为超声破碎法或溶菌酶裂解法，细菌裂解后的离心为12000转/分，持续30分钟，取上清液；初步纯化的方法为离子交换层析或分子筛法。

7、一种表达纯化重组人硒蛋白P基因中的专用引物，其基因序列为

引物15′GTGGTTGTGACAACCCCAGC 3′

引物25′AATGGAAAGCATGTCTTTGT 3′

8、一种表达纯化重组人硒蛋白P基因中的专用培养基，由下列配方组成：

      富硒酵母提取物    8-12克

      蛋白冻            16-20克

      亚硒酸钠          1-20微克

      氯化钠            10克

      加无离子水至1000毫升

9、根据权利要求8所述的一种表达纯化重组人硒蛋白P基因中的专用培养基，其特征在于：它是由下列配方组成的：

      富硒酵母提取物      10克

      蛋白冻              16克

     亚硒酸钠             5微克

     氯化钠               10克

     加无离子水至1000毫升