[发明专利]苹果酸脱氢酶的靶向修饰

说明书

本申请公开了用于靶向修饰一种或多种内源性植物苹果酸脱氢酶基因的方法和组合物。

对相关申请的交叉引用

本申请要求2012年5月2日提交的美国临时申请No.61/641,776和2013年3月13日提交的美国临时申请No.61/780,512的权益，其公开通过引用全文并入本文。

对在联邦科研资助下完成的发明的权利声明

不适用。

技术领域

本申请公开为基因组工程领域，尤其是内源的植物苹果酸脱氢酶(malatedehydrogenase)(MDH)基因的改变表达和/或靶向修饰。

背景

生物技术作为一种努力满足食品生产的全球性增加需求的挑战的关键性技术而出现。改善如增加产量或工程化的抗虫性的农业生产力的传统方法，依赖于突变育种或将新基因通过转化导入到作物品种的基因组中。两种处理均为内在非特异性和相对低效的。例如，传统的植物转化方法递送整合到随机位置的基因组中的外源基因。由此，为了鉴定和分离具有所需属性的转基因系，需要产生成千的独特的随机整合事件并接着筛选所需要的事件。因此，传统植物性状工程化是一项费力的、耗时且不可预测的事情。并且这些整合的随机性质使得难以预测多效性结果是否由于无意的基因组中断而发生。因此，具有工程化的转基因或性状的植物系的产生、分离以及表征是一项极为劳动和成本密集性且具有低成功可能性的过程。

靶基因修饰克服了植物系统中传统操作上的逻辑性挑战，并且由此已经是基础植物生物研究和农业生物技术中的一个长期存在但难理解的目标。然而，除了通过在稻中的阳性-阴性药物选择或使用预工程化的限制性位点的“基因靶向”以外，在所有植物物种(包括模式和作物)中的靶向性基因组修饰直至最近仍被证实是非常困难的。Terada等人，(2002)Nat Biotechnol 20(10):1030；Terada等人，(2007)Plant Physiol 144(2):846；D'Halluin等人，(2008)Plant Biotechnology J.6(1):93。

最近，基因组DNA靶向切割的方法和组合物已经被记载。这样的靶向性切割事件可以用于，例如诱导靶向性诱变，诱导细胞DNA序列的靶向突变(例如缺失、取代和/或插入)，和易化在预先确定的染色体基因座处的靶向重组和整合。参见，例如Urnov等人，(2010)Nature 435(7042):646-51；美国专利公开号20030232410；20050208489；20050026157；20050064474；20060188987；20090263900；20090117617；20100047805；20110207221；20110301073；2011089775和国际公开号WO 2007/014275，其公开出于所有目的通过引用全文并入本文中。切割可以通过使用特定核酸酶例如工程化的锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、归巢内切核酸酶(homing endonucleases)而发生，或使用具有工程化的crRNA/tracr RNA('single guide RNA')的CRISPR/Cas系统以引导特异性的切割。美国专利公开号20080182332记载了使用非规范性(non-canonical)锌指核酸酶用于植物基因组的靶向修饰；美国专利公开号20090205083记载了在植物EPSPS基因座由ZFN介导的靶向修饰；美国专利公开号20100199389记载了在植物Zpl5基因座的靶向修饰和美国专利公开号20110167521记载了对参与脂肪酸生物合成的植物基因的靶向修饰。此外，Moehle等人，(2007)Proc.Natl.Acad，Sci.USA 104(9):3055-3060记载了利用设计的ZFN在特定基因座进行靶向性基因添加。