[发明专利]S100A4蛋白的纯化与鉴定无效
申请号: | 200910070460.0 | 申请日: | 2009-09-17 |
公开(公告)号: | CN102020708A | 公开(公告)日: | 2011-04-20 |
发明(设计)人: | 王天辉;刘洪涛;徐传香;刘子泉;陈学伟;崔博;佘晓俊;张娜;马强 | 申请(专利权)人: | 中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所 |
主分类号: | C07K14/435 | 分类号: | C07K14/435;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/22;G01N27/447;G01N33/548 |
代理公司: | 暂无信息 | 代理人: | 暂无信息 |
地址: | 300050*** | 国省代码: | 天津;12 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | s100a4 蛋白 纯化 鉴定 | ||
技术领域
本发明涉及一种蛋白分子的纯化与鉴定。具体的说,本发明涉及一种具有高效表达活性的S100A4蛋白分子的纯化与鉴定。
背景技术
S100A4蛋白是以非共价键结合二聚体存在于细胞内,而以共价结合二聚体分泌到细胞外。推测Ca2+结合后可导致S100A4蛋白构型改变,在表面暴露出新的结合位点,从而可与一系列靶标结合。胞外基质中的S100A4蛋白是一种单体和二聚体共存的状态,其比例受Ca2+结合程度的影响;胞内S100A4蛋白的同源二聚体和异源二聚体形式也是同时存在。因此,从S100A4蛋白可形成同源二聚体、异源二聚体、寡聚体的多种形式来看,其结构具有很强的可变性,这可能也是它在体内具有多种生物学功能的结构基础。
S100A4蛋白与肿瘤的发生、转移及预后密切相关,参与血管生成、细胞外基质重建等生命过程。因此,构建S100A4蛋白载体、表达并纯化S100A4蛋白,可以用于与P53等靶分子相互作用的基础研究,以揭示其作用机制。
发明内容
本发明提供了一种纯化与鉴定S100A4蛋白的方法。该方法包括如下步骤:
(1)S100A4蛋白的纯化
①将层析柱连接AKTA FPLC蛋白纯化仪,并以约5倍体积的1×binding buffer平衡至基线。
②平衡以后,将破碎上清以1×binding buffer稀释3-5倍以0.45μm的除菌滤器过滤除菌后以3mL/min的流速上样,收集穿透液。
③以1×binding buffer平衡至基线,用elution buffer(洗脱缓冲液)进行线性梯度洗脱,以3mL/管收集蛋白峰,进行SDS-PAGE鉴定和纯度鉴定。
(2)S100A4蛋白的脱盐
为了加快纯化速度,防止蛋白在纯化过程中降解,采用GE Health HiTrap Desalting柱进行脱盐处理,程序参照该层析柱说明书,简言之,缓冲液为生理盐水缓冲液,平衡柱子3-5个柱床体积后,用注射器手推上样,上样过程中弃去所有的流出液,上样完毕后,将层析柱连接FPLC系统,监测紫外和电导,收集相应紫外峰,所需蛋白先洗脱,盐类等小分子后洗脱,收集蛋白峰,进行SDS-PAGE分析
(3)蛋白鉴定
a SDS-PAGE鉴定
①将上一步骤中收集的破碎后上清液吸取25μl,再加入25μl的2×SDS上样缓冲液,混合均匀;
②取破碎后的沉淀少许,加入25μl的PBS后,再加入25μl的2×SDS上样缓冲液,混合均匀;
③将上述两者100℃煮沸5min,并短暂离心,进行SDS-PAGE电泳,鉴定其表达形式。
b Western-Blot鉴定
①处理好蛋白样品,进行SDS-PAGE电泳,记录加样顺序。
②电泳完毕后,取下凝胶,标记方向,切取所需大小的胶。
③量取一张与胶块大小相同的硝酸纤维素膜;6张滤纸,大小同凝胶。
④将滤纸用转移buffer湿润,取3张叠放于半干转移仪上,将硝酸纤维素膜叠放上去后,把大小相同的凝胶叠放上去,再将转移buffer湿润的滤纸3张叠放上去。
⑤检查气泡,接通半干转移仪,以1mA/cm2的电量,开始转移1h-1.5h。
⑥转移完毕后,取下硝酸纤维素膜,放入平皿,加入15~20mL的B液,封闭过夜(轻摇)
⑦封闭结束后,用D液洗膜3次,2min/次,加入15~20mL的用C液稀释好的一抗(兔抗S100A4),轻摇1h。
⑧再用D液洗膜3次,2min/次,加入15-20mL的用C液稀释好的酶标二抗(羊抗兔IgG-HRP),轻摇1h。
⑨再用D液洗膜3次,2min/次,加入A液配制好的DAB(0.35g/L)10mL,再加入H2O230μL观察特异性反应,2-3min后,用2mol/L的硫酸终止反应,用蒸馏水冲洗膜
附图说明
图1为S100A4的SDS-PAGE电泳分析
图2为纯化后S100A4的SDS-PAGE电泳分析
图3为S100A4的Western blot鉴定结果
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明:
(1)S100A4蛋白的纯化
①将层析柱连接AKTA FPLC蛋白纯化仪,并以约5倍体积的1×binding buffer平衡至基线。
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- 本发明提供了一种可应用于鱼虾饲料添加剂或抗病药物开发的凡纳滨对虾新型抗菌肽基因CrustinA的核酸序列、重组蛋白表达载体、菌株的制备方法及其应用。所述CrustinA的核酸序列长688bp,开放阅读框架编码173个氨基酸,推测蛋白分子量大小为18.5KDa,重组蛋白表达载体pYE‑GAPα‑CrustinA转化到毕赤酵母GS115,获得可稳定表达CrustinA的重组蛋白菌株。采用本发明制备的表达菌株以及其表达的重组抗菌肽蛋白具有良好的抗菌效果,可应用于生产鱼类和虾类抗菌药物、疫苗或饲料添加剂。
- 凡纳滨对虾抗菌肽-CrustinB基因及其重组蛋白的制备与应用-201610421494.X
- 黎铭;马春霞;李朝政;彭金霞;何苹萍;陈晓汉 - 广西壮族自治区水产科学研究院
- 2016-06-12 - 2019-07-30 - C07K14/435
- 本发明提供了一种可应用于鱼虾饲料添加剂或抗病药物开发的凡纳滨对虾新型抗菌肽基因CrustinB的核酸序列、重组蛋白表达载体、菌株的制备方法及其应用。所述CrustinB的核酸序列长178bp,开放阅读框架编码197个氨基酸,推测蛋白分子量大小为19.3KDa,重组蛋白表达载体pYE‑GAPα‑CrustinB转化到毕赤酵母GS115可以获得稳定的表达CrustinB重组蛋白的菌株。采用本发明制备的表达菌株以及其表达的重组抗菌肽蛋白具有良好的抗菌效果,可应用于生产鱼类和虾类抗菌药物、疫苗或饲料添加剂。
- 一种地龙蛋白混合澄清提取装置-201910338257.0
- 贾立明 - 天津贾立明蚯蚓养殖有限公司
- 2019-04-25 - 2019-07-26 - C07K14/435
- 本发明公开了一种地龙蛋白混合澄清提取装置,属于地龙提取设备技术领域,包括固定底座,固定底座上端两侧安装有支撑架,支撑架顶端内侧安装有支撑柱,支撑柱之间安装有混合筒,固定底座上端中部安装有提取箱,提取箱中部安装有过滤网,混合筒内部安装有混合轴,混合轴右端穿过支撑柱和支撑架连接有从动齿轮,从动齿轮右端啮合有主动齿轮,主动齿轮下端连接有旋转轴,旋转轴中部设有曲柄,曲柄中部安装有滑套,滑套左端连接有摆动柱,摆动柱左端连接有摆动网。本发明,可以使得摆动网进行左右摆动,进一步提高过滤效果,同时通过活塞杆与活塞缸之间配合,实现了对过滤网过滤后溶液的吸取,提高了过滤效率。
- 一种生产水解过敏原的方法-201811504909.5
- G·普拉西尔;L·弗里西;T·莱贡;M-A·贝努瓦 - 阿西特生物技术股份公司
- 2012-06-15 - 2019-07-23 - C07K14/435
- 一种从过敏原生产水解过敏原的方法,包括以下步骤:a)对包含过敏原蛋白的过敏原来源进行提取,从而形成提取物,b)纯化所述提取物以除去非蛋白组分从而形成纯化的提取物,c)使用第一变性剂对所述纯化的提取物进行变性,从而形成纯化的变性提取物,d)精制所述纯化的变性提取物,以除去杂质,从而形成精制的变性提取物,e)使用第二变性剂对所述精制的变性提取物进行变性,从而形成变性的过敏原混合物,和f)对所述变性的过敏原混合物进行水解,从而形成所述水解的过敏原。
- 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体及其使用方法-201910017754.0
- W.埃科特;M.弗林斯帕奇;M.亨特;Y.刘;R.内夫;A.维肯登;A.吉布斯 - 詹森生物科技公司
- 2013-05-17 - 2019-07-23 - C07K14/435
- 本发明涉及虎纹捕鸟蛛毒素‑IV变体、编码它们的多核苷酸、制备和使用前述物质的方法、以及用Nav1.7的肽抑制剂减轻疼痛的方法。本发明的一个实施例包括含有载体的宿主细胞,所述载体包含编码本发明的虎纹捕鸟蛛毒素‑IV变体的分离的多核苷酸。
- 一种天然蜘蛛丝蛋白粉的制备方法-201910371851.X
- 何创龙;林煌;张骞骞;朱一强;李廷辉 - 东华大学
- 2019-05-06 - 2019-07-19 - C07K14/435
- 本发明涉及一种天然蜘蛛丝蛋白粉的制备方法,通过将天然蜘蛛丝用氢氧化钠溶液进行脱胶处理,冷冻干燥后,加入甲酸溶液在水浴加热下溶解,然后在高速离心机中离心取上清,冷冻干燥后即获得蛛丝蛋白粉。本发明制备方法简单,得到的蛛丝蛋白粉在水中有良好的分散性。
- 专利分类