[发明专利]一种将目的基因多拷贝整合至酿酒酵母基因组的方法在审
| 申请号： | 201911085952.7 | 申请日： | 2019-11-08 |
| 公开（公告）号： | CN110699383A | 公开（公告）日： | 2020-01-17 |
| 发明（设计）人： | 蒋玮;唐雪明 | 申请（专利权）人： | 上海市农业科学院 |
| 主分类号： | C12N15/90 | 分类号： | C12N15/90;C12N9/22;C12R1/865 |
| 代理公司： | 31280 上海申浩律师事务所 | 代理人： | 陶国南 |
| 地址： | 201106 *** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | 一种将目的基因多拷贝整合至酿酒酵母基因组的方法，选择靶序列，将对应靶序列中切割位点两侧的同源臂引物设计至扩增目的基因表达盒的引物前端，合成同源臂加载引物，扩增目的基因表达盒，获得供体DNA片段，同源臂引物长度为15‑90bp；将相应靶序列的转录gRNA的载体和供体DNA片段共转化至表达Cas9核酸酶的酿酒酵母中，实现基因整合；无抗性平板去除Cas9核酸酶表达载体和转录gRNA的载体。本发明中切割位点两侧的同源臂引物序列长度在15‑90bp，在目的基因表达盒的上下游引物分别加上这些同源臂，可以直接一次PCR得到整合基因模板，实现目的基因的多拷贝整合，比现有的方法耗时短，操作更简单。 | ||
| 搜索关键词： | 目的基因 同源臂 引物 靶序列 表达盒 转录 切割位点 供体DNA 多拷贝 核酸酶 扩增 整合 酿酒酵母基因组 表达载体 基因整合 抗性平板 酿酒酵母 引物设计 引物序列 整合基因 一次PCR 共转化 加载 去除 耗时 合成 | ||
【主权项】：
1.一种将目的基因多拷贝整合至酿酒酵母基因组的方法，包括以下步骤：/n1)将Cas9核酸酶表达载体转化至酿酒酵母中表达；/n2)选择酿酒酵母多拷贝rDNA重复单元NTS2非转录区中的一个或多个靶序列，将所选择靶序列中切割位点两侧的同源臂引物设计至目的基因表达盒的PCR扩增引物的前端，合成同源臂加载引物，扩增一个或多个目的基因表达盒，纯化扩增产物作为供体DNA片段；所述靶序列中切割位点两侧的同源臂引物的序列长度为15-90bp，所述酿酒酵母多拷贝rDNA重复单元NTS2非转录区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；/n3)选择靶序列对应的转录gRNA的载体，与步骤2)中的供体DNA片段共转化至步骤1)中表达Cas9核酸酶的酿酒酵母中，筛选转化子；/n4)去除筛选出的转化子中在步骤1)和步骤2)导入的载体。/n
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