[发明专利]一种将目的基因多拷贝整合至酿酒酵母基因组的方法

说明书

一种将目的基因多拷贝整合至酿酒酵母基因组的方法，选择靶序列，将对应靶序列中切割位点两侧的同源臂引物设计至扩增目的基因表达盒的引物前端，合成同源臂加载引物，扩增目的基因表达盒，获得供体DNA片段，同源臂引物长度为15‑90bp；将相应靶序列的转录gRNA的载体和供体DNA片段共转化至表达Cas9核酸酶的酿酒酵母中，实现基因整合；无抗性平板去除Cas9核酸酶表达载体和转录gRNA的载体。本发明中切割位点两侧的同源臂引物序列长度在15‑90bp，在目的基因表达盒的上下游引物分别加上这些同源臂，可以直接一次PCR得到整合基因模板，实现目的基因的多拷贝整合，比现有的方法耗时短，操作更简单。

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种将目的基因多拷贝整合至酿酒酵母基因组的方法。

背景技术

酿酒酵母系统是最重要的外源基因表达系统之一，已广泛用于生物制剂的合成。酿酒酵母存在高效的同源重组机制，两个DNA分子间只要有30-50bp长的同源区段就可以准确、有效地进行同源重组。根据酿酒酵母较易发生同源重组的特点，使用重复序列作为整合载体同源重组位点是提高外源基因在酵母基因组中拷贝数的有效途径。

酵母基因组中rDNA有100-200个重复单元，拷贝数相比于其他位点的拷贝数具有明显的增加，是构建高拷贝整合表达载体同源重组区的首选序列，每个rDNA重复单元长达9.1kb左右，由5SrDNA和35SrDNA基因构成的转录区和由NTS1和NTS2构成的非转录区所组成。

CRISPR/Cas9技术是近些年的新技术，因其可广泛并精准编辑生物基因组，一经问世，便成为世界上最炙手可热的焦点之一。CRISPR/Cas技术分为三类，Cas9介导的基因编辑技术属于Ⅱ类，最常用于真核细胞的基因修饰。

CRISPR/Cas9技术主要包含三个要素——有核酸双链剪切功能的Cas9蛋白、识别靶基因序列的gRNA和用于编辑的供体DNA片段。工作原理即为Cas9蛋白在特异性gRNA的引导下剪断靶位点核酸双链，再通过细胞内DNA修复系统、同源重组系统(HR)、非同源末端连接途径(NHEJ)修复断裂的DNA双链，实现基因的敲除和插入。CRISPR/Cas9技术的出现为高效精确的基因定点修饰技术提供了一个全新的平台，对现代生物学研究有着划时代的意义。

在科学家的不断研究下，CRISPR/Cas9系统逐步升级，最终探索出一套非常简便易行的系统。该系统由Cas9蛋白和gRNA两部分组成，gRNA包含crRNA和tracrRNA两部分结构，tracrRNA通过与Cas9蛋白结合形成Cas9-gRNA复合体起到引导切割的作用，crRNA含有20个碱基的向导序列(N₂₀)，该20个碱基能通过碱基互补配对与靶序列结合起到定位作用；在靶序列的下游存在一个被称为PAM(proto-spacer adjacent motifs)，即“前间区邻近基序”的保守序列，PAM序列的有无决定了Cas9蛋白是否切割靶序列。在该系统中，Cas9在gRNA的引导下切割靶DNA序列，产生双链DNA断裂，供体DNA片段的加入提供了细胞利用同源重组的方式修复双链DNA断裂的同源臂，实现靶DNA序列的删除或插入。

目前使用CRISPR/Cas9技术的高拷贝整合目的基因的方法中，供体DNA同源臂多在500bp甚至1000bp以上，需要分别PCR扩增上、下游同源臂以及所需插入的基因表达盒并将它们组装，步骤繁琐。另外，进行一次整合多个基因时，过长的同源臂会相互影响靶序列的选择，难以实现较多基因的一次整合。

发明内容

本发明的目的在于提供一种将目的基因多拷贝整合至酿酒酵母基因组的方法，在酿酒酵母的多拷贝rDNA重复单元中寻找到4个靶序列，并设计了对应的同源臂引物，将同源臂分别设在Cas9核酸酶在4个靶序列中切割位点的两侧，实现基因的无缝插入，可以实现目的基因的多拷贝整合，并且可以实现一次整合最多4个基因，耗时短，操作简单。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案如下：