[发明专利]一种不依赖于酶的新型基因克隆方法在审
| 申请号： | 201910787163.1 | 申请日： | 2019-08-25 |
| 公开（公告）号： | CN110499310A | 公开（公告）日： | 2019-11-26 |
| 发明（设计）人： | 袁慧;田文奇 | 申请（专利权）人： | 苏州博睐恒生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/10 | 分类号： | C12N15/10;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19 |
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| 地址： | 215300 江苏省苏*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种不依赖于酶的新型基因克隆方法，包括步骤为：用引物扩增目标基因和质粒载体；将目标基因扩增产物和质粒载体扩增产物进行碘酒热处理；将热处理后的目标基因DNA片段与质粒载体DNA片段杂交配对，形成含目标基因的带缺口重组质粒；所述含目标基因的带缺口重组质粒转化大肠杆菌，修复重组质粒中的缺口，形成含目标基因的完整重组质粒。通过上述方式，本发明采用最优的硫代修饰与单链末端长度控制策略，含有目标基因的阳性克隆率高，操作通量大，适宜于多个目标基因同时克隆。 | ||
| 搜索关键词： | 目标基因 质粒载体 重组质粒 热处理 扩增产物 重组质粒转化大肠杆菌 克隆 长度控制 多个目标 硫代修饰 新型基因 阳性克隆 引物扩增 单链 碘酒 配对 通量 杂交 修复 基因 | ||
【主权项】：
1.一种不依赖于酶的新型基因克隆方法，其特征在于，包括步骤为：/n（1）用引物扩增目标基因和质粒载体，其中引物序列的特征为：（a）5’端第1-25位间的磷酸二酯键为间隔性硫代修饰，相邻硫代修饰间相隔5-8碱基；（b）扩增目标基因和质粒载体的正向引物的5’端第1-25位间的碱基序列彼此互补配对，扩增目标基因和质粒载体的反向引物的5’端第1-25位碱基序列彼此互补配对；（c）3’端下游18-25个碱基序列与待扩增的目标基因和质粒载体的DNA片段两端碱基序列配对；/n（2）将目标基因扩增产物和质粒载体扩增产物进行碘酒热处理，在目标基因和线性化载体的硫代修饰处断裂DNA中的磷酸二酯键，断裂后形成的5-8个核苷酸的短链DNA从互补链上脱离，从而在DNA片段的两端产生长度为10-25个核苷酸的3’突出端，单链的长度取决于距离5’端最远的一个硫代修饰距离5’端的距离；（3）将热处理后的目标基因DNA片段与质粒载体DNA片段杂交配对，形成含目标基因的带缺口重组质粒；/n（4）所述含目标基因的带缺口重组质粒转化大肠杆菌，修复重组质粒中的缺口，形成含目标基因的完整重组质粒。/n
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