[发明专利]一种不依赖于酶的新型基因克隆方法

说明书

本发明公开了一种不依赖于酶的新型基因克隆方法，包括步骤为：用引物扩增目标基因和质粒载体；将目标基因扩增产物和质粒载体扩增产物进行碘酒热处理；将热处理后的目标基因DNA片段与质粒载体DNA片段杂交配对，形成含目标基因的带缺口重组质粒；所述含目标基因的带缺口重组质粒转化大肠杆菌，修复重组质粒中的缺口，形成含目标基因的完整重组质粒。通过上述方式，本发明采用最优的硫代修饰与单链末端长度控制策略，含有目标基因的阳性克隆率高，操作通量大，适宜于多个目标基因同时克隆。

技术领域

本发明涉及基因工程技术，特别是涉及一种不依赖于酶的新型基因克隆方法。

背景技术

基因克隆技术是蛋白质工程、基因工程、基因编辑等技术的基础。传统基因克隆技术涉及目标基因片段与质粒载体的限制性核酸内切酶消化、连接酶连接环化目标基因与质粒这两步必不可少的操作。传统基因克隆技术缺点主要有：1）如果基因内部具有选用的限制性酶切位点，则导致无法进行该基因的克隆，该问题对长片段的基因的克隆尤其明显；2）不同基因选用的合适内切酶不一样，需要不同的限制性内切酶进行处理，因此很难同时克隆多个基因；3）限制性核酸内切酶消化反应与DNA连接酶反应，特别是限制性核酸内切酶消化反应，效率的高低直接决定着目标基因克隆能否成功。

由于限制性核酸内切酶消化反应与DNA连接酶反应，常常造成含有目标基因的阳性重组质粒百分比低于10%，甚至克隆失败。为了克服常规基因克隆方法的缺陷，开发了一些连接酶非依赖性克隆方法，例如基于T4 DNA聚合酶的连接酶非依赖性克隆方法（NucleicAcids Research, Vol. 18, No. 20 p6069-6074），基于外切核酸酶的连接酶非依赖性克隆方法（Nucleic Acids Res 21: 5528-5529；Biotechniques 27: 1240-1244）。然而，基于T4 DNA聚合酶的连接酶非依赖性克隆方法缺点主要有：1）需要在目标基因与线性质粒载体的5’端引入一段特定的碱基序列，导致克隆的目标基因的两端附加了一段人为的碱基序列；2）引入的一段特定碱基序列有时较难设计，造成目标基因克隆困难。而基于外切核酸酶的连接酶非依赖性克隆方法的缺陷主要包括：DNA修饰酶对DNA的处理程度较难控制，不能有效控制单链突出端长度，常常会导致DNA的完全降解或降解达不到15个核苷酸，使得基因克隆失败。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种不依赖于酶的新型基因克隆方法，其不需要包括限制性核酸内切酶、DNA连接酶，以及用来生成单链突出端的核酸外切酶、DNA重组酶等任何DNA修饰酶，而是通过碘酒热断裂硫代修饰的目标DNA和克隆载体；该方法能简化基因克隆操作、提高克隆效率与操作通量，可用于大规模基因克隆，可以用于重组载体构建和基因点突变；同时相关试剂常温储存长期稳定，储存非常简单方便。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种不依赖于酶的新型基因克隆方法，包括步骤为：（1）用引物扩增目标基因和质粒载体，其中引物序列的特征为：（a）5’端第1-25位间的磷酸二酯键为间隔性硫代修饰，相邻硫代修饰间相隔5-8碱基；（b）扩增目标基因和质粒载体的正向引物的5’端第1-25位间的碱基序列彼此互补配对，扩增目标基因和质粒载体的反向引物的5’端第1-25位碱基序列彼此互补配对；（c）3’端下游18-25个碱基序列与待扩增的目标基因和质粒载体的DNA片段两端碱基序列配对；（2）将目标基因扩增产物和质粒载体扩增产物进行碘酒热处理；（3）将热处理后的目标基因DNA片段与质粒载体DNA片段杂交配对，形成含目标基因的带缺口重组质粒；（4）所述含目标基因的带缺口重组质粒转化大肠杆菌，修复重组质粒中的缺口，形成含目标基因的完整重组质粒。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（1）中所述扩增采用的是聚合酶链式反应PCR，扩增反应缓冲液中包括有用于扩增目标基因和质粒载体的正向引物、用于扩增目标基因和质粒载体段的反向引物、目标基因与质粒载体的DNA模板分子、DNA聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸。