[发明专利]用于黄瓜幼苗基因定位研究的RNA原位杂交优化方法

摘要

本发明涉及一种用于黄瓜幼苗基因定位研究的RNA原位杂交优化方法。首先，根据黄瓜幼苗植株材料特性，改进植物培养、取样和固定的方法，从而获得含目标组织的完整植物结构；其次，针对性优化切片准备、杂交预处理、杂交孵育封片和显色反应镜检等操作手法，从而提高基因定位结果的可靠性、准确性和特异性；最后，针对性设计适合黄瓜幼苗成熟组织的显色反应终止后的处理方案，以便排除细胞内含物的干扰，直接观察杂交信号的分布。本发明不仅用于提高实验结果的灵敏性和准确性，还通过提高药品利用率、减少实验用品消耗、增加反应产物产率、节省劳动成本等方法降低了经济成本，因此本发明是一套兼顾科学性、创新性和实用性的科学研究方法。

主权项

1.一种用于黄瓜幼苗基因定位研究的RNA原位杂交优化方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤1，试验材料的培养，所述试验材料为黄瓜幼苗；/n黄瓜幼苗的地上部组织材料对培养条件无特殊要求，地下部组织材料的培养方式为组培、水培、沙培和土培；所述土培为采用细土培养；/n步骤2，试验材料的取样与固定；/n在冰上取样，切取3～4cm长度的黄瓜幼苗的茎和包含侧根的根系片段作为植物样品，进行包埋得到包埋样品，对包埋样品进行修块切分，得到组织样品；/n步骤3，目标基因的探针制备，并进行探针纯化；/n探针的转录模版由模版片段和T7/Sp6启动子序列两部分组成，正义探针与反义探针与启动子连接方向相反，正义探针是目标基因的阴性对照，反义探针是目标基因的互补序列，与靶基因结合显示目标基因的位置，它们是带目标基因的转录模版体外转录产物；/n根据目标基因的mRNA序列长度和荧光定量qPCR结果，选取GG起始，GC含量为40％～70％的目标基因片段做模版片段；/n步骤4，杂交切片的准备；/n对步骤2得到的组织样品，通过切片机制得石蜡切片，并对石蜡切片进行筛选，筛选后先后进行摊片、烘片，得到杂交切片；/n切片过程中，及时检查并清理刀片上的蜡渍，避免划痕导致的样品碎裂；/n经过筛选后的石蜡切片，平放于37℃RNase-free水中进行摊片，待石蜡切片软化后完全摊开，颜色由白变为近乎透明，再用毛笔轻轻拖起摊在载玻片上，毛笔轻压赶走气泡，再用吸水纸轻压吸去水分，以此减少烘片的时间并提升烘片的效果，避免后期样品与载玻片分离，得到杂交切片；/n步骤5，杂交预处理；/n对杂交切片进行脱蜡、脱色，对包裹靶分子的蛋白质进行处理，使靶分子充分暴露出来；将最终得到的杂交切片样品保存在4℃冰箱，置于底部添加少量无水乙醇的封口膜密封的染色缸内的染色架上；/n步骤6，杂交孵育封片：/n对步骤5得到的杂交切片样品，先使用一抗进行第一次杂交孵育，然后使用二抗进行第二次杂交孵育，所述一抗是DIG-11-UTP探针，二抗是DIG-AP；使用含抗体的RNA杂交液淋洗孵育处理后的杂交切片样品，然后使用含抗体的RNA杂交液封片以进行孵育；/n步骤7，显色反应镜检：/n当黄瓜幼苗期基因的荧光定量PCR的CQ值为15≤CQ＜25,内参基因CQ值为15时，在显色反应开始6h内进行一次镜检查看杂交信号；当黄瓜幼苗期基因的荧光定量PCR的CQ值为25≤CQ≤30，内参基因CQ值为15时，在第二天开始，每天上午、下午或晚上各进行一天2次的镜检；/n镜检时避光，将步骤6中封片后的杂交切片样品置于NBT/BCIP显色底物缓冲液中分开，用NBT/BCIP显色底物缓冲液制作临时装片，然后置于显微镜下检查杂交信号，若观察到清晰的杂交信号分子，终止显色反应；否则，用NBT/BCIP显色底物缓冲液重新冲洗样品，然后将两片载玻片重新对粘并放回考普林杯中继续反应；/n步骤8，反应终止后处理：/n对于观察到杂交信号的组织样本，用清水终止显色反应，然后置于室温晾干，最后每张载玻片直接用90μl中性树脂：二甲苯为1:1的混合液进行封片，实验结果永久保存。/n